牛副結(jié)核抗體間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、副結(jié)核病(Paratuberculosis)也稱為副結(jié)核性腸炎，是一種常見的由副結(jié)核分枝桿菌感染引起的以牛、羊、鹿等反芻動物為主的慢性消耗性傳染病。目前對該病尚無有效的治療方法和預(yù)防措施，根除此病的唯一辦法就是檢出、隔離、淘汰。因此建立快速準(zhǔn)確的檢測方法非常必要。
　　根據(jù)GenBank中已公布的牛副結(jié)核分枝桿菌兩個主要抗原MAP0862和MAP2154c的全基因序列，利用DNAstar軟件和BepiPred1.0在線預(yù)測軟件對M

2、AP0862和MAP2154c進(jìn)行預(yù)測分析，篩選出抗原指數(shù)高的抗原表位基因，將基因序列合成得到融合基因PUC-K-map0862-2154c。以此基因為基礎(chǔ)，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET0862-2154c，將其轉(zhuǎn)化至克隆菌株E.coli DH5α中。提取陽性大腸桿菌pET0862-2154c/DH5α質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。正確的重組質(zhì)粒pET0862-2154c轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.coli Rosetta(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)的重組蛋

3、白MAP0862-2154c分子質(zhì)量約為29kDa(含約8 kDa pET-28a(+)的肽段）;純化后的重組蛋白MAP0862-2154c具有良好的抗原性。
　　選用7周齡的BALB/c小鼠，用純化的重組蛋白進(jìn)行免疫試驗，小鼠血清的ELISA抗體效價大于1∶6400，說明該重組蛋白免疫原性好。
　　將純化的牛副結(jié)核分支桿菌重組蛋白MAP0862-2154c作為包被抗原，建立了牛副結(jié)核抗體的間接ELISA檢測方法。通過各步反

4、應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定了該方法的最佳反應(yīng)條件:抗原最適包被濃度為1μg/mL;抗原經(jīng)4℃包被過夜;最佳封閉條件為含2％明膠的CBS，37℃封閉2h;最適稀釋液為含0.5％明膠的PBST;最適血清稀釋度為1∶800，37℃作用1h;1∶100000為酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度，37℃作用45min;底物于37℃避光顯色15 min。該方法與牛布氏桿菌病、牛病毒性腹瀉和牛傳染性鼻氣管炎病陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)都小于