間接ELISA檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌抗體方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，簡(jiǎn)稱(chēng)RA)引起鴨的傳染性漿膜炎(Infectiousserositis)，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最重要的病原之一。在生產(chǎn)實(shí)踐中，現(xiàn)有的間接ELISA方法雖然能夠檢測(cè)出RA抗體，但不能區(qū)分是人工感染還是滅活疫苗免疫后產(chǎn)生的。本研究分別以RA菌體超聲波裂解抗原、RA脂多糖抗原、原核表達(dá)CAM融合蛋白為包被抗原建立了間接ELISA方法，并應(yīng)用于人工感染RA鴨恢復(fù)期血清和滅活疫苗免疫鴨血清抗

2、體，為疫苗的研制及血清流行病學(xué)研究提供血清學(xué)檢測(cè)的手段。研究結(jié)果如下： 1.本試驗(yàn)用pETCAM表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，用0.4mmolIPTG在30℃下誘導(dǎo)4小時(shí)后有最大表達(dá)量，通過(guò)WesternBlot對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行了鑒定及利用His·Bind親和柱層析純化獲得37kD左右的CAM融合蛋白。 2.間接ELISA方法的建立(1)本試驗(yàn)以蛋白質(zhì)濃度91ug/ml的菌體超聲波裂解物作包被抗原，成功

3、建立了檢測(cè)RA抗體的間接ELISA方法(PRO-ELISA)，其最適待檢血清和兔抗鴨IgG血清的稀釋倍數(shù)均為1∶800；對(duì)鴨抗多殺性巴氏桿菌、Ⅰ型鴨病毒性肝炎、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、鴨瘟等血清的檢測(cè)結(jié)果為陰性；阻斷試驗(yàn)結(jié)果為陰性；板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別為3.86％-16.8％、6.17％-9.46％。 (2)本試驗(yàn)以多糖濃度為26ug/ml的脂多糖抗原作包被抗原，成功建立了檢測(cè)RA抗體的間接ELISA方法(LPS-ELISA)，其

4、最適待檢血清和兔抗鴨IgG血清的稀釋度分別為1∶200、1∶400；對(duì)鴨抗多殺性巴氏桿菌、Ⅰ型鴨肝炎病毒、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、鴨瘟病毒等血清檢測(cè)結(jié)果呈陰性；阻斷試驗(yàn)結(jié)果為陰性；板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別為4.73％-6.90％、5.30％-11.9％。 (3)本試驗(yàn)以蛋白質(zhì)濃度22.51ug/ml的CAM融合蛋白作包被抗原，成功建立了檢測(cè)RA抗體的間接ELISA方法(CAM-ELISA)，其最適待檢血清和兔抗鴨IgG血清的稀釋度分別

5、為1∶400、1∶200；對(duì)鴨抗多殺性巴氏桿菌、Ⅰ型鴨肝炎病毒、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、鴨瘟病毒等陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果呈陰性；阻斷試驗(yàn)結(jié)果為陰性；板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別為5.85％-16.3％、4.22％-9.37％。 3.間接ELISA用于人工感染RA鴨恢復(fù)期血清和滅活疫苗免疫鴨血清抗體檢測(cè)PRO-ELISA能從滅活疫苗免疫后第5天的鴨血清中檢測(cè)到抗體(P/N=7.11)；能從人工感染RA后第三天的鴨血清中檢測(cè)出抗體(P/N=6.1

6、2)，第21天抗體抗體水平達(dá)到高峰(P/N=17.26)，隨后抗體水平開(kāi)始下降。 滅活疫苗免疫20天內(nèi)的鴨血清利用LPS-ELISA不能檢測(cè)到抗體(P/N＜3)，但二免后抗體水平迅速上升及第5天和第25天的抗體水平分別為4.25和9.34(P/N)。LPS-ELISA能從人工感染RA后第三天的鴨血清中檢測(cè)出抗體(P/N=4.87)，第21天抗體抗體水平達(dá)到高峰(P/N=17.04)，隨后抗體水平開(kāi)始下降。 利用CAM-E