雞沙門菌病抗體間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、雞沙門菌病在我國仍然廣泛流行，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)。外表健康的患雞容易向外排菌，使雞蛋、雞肉等產(chǎn)品遭受污染，給食品安全和公眾健康帶來一定的危險(xiǎn)，容易造成人食物中毒。
　　 由于沙門菌感染后能終身帶菌，并可通過種蛋垂直傳給雛雞，因此鑒定并淘汰陽性種雞十分必要。長期以來，養(yǎng)雞場一直使用玻板凝集試驗(yàn)檢測淘汰患雞白痢、雞傷寒的病雞，但是該方法敏感性有限，經(jīng)常漏檢。感染雞間歇性排毒或不排毒，使得傳統(tǒng)分菌的方法不夠敏感。感染性沙門菌血清型眾多，傳

2、統(tǒng)ELISA方法不能滿足實(shí)際需求。
　　 沙門菌InvJ蛋白是廣泛存在于沙門菌中的保守蛋白，使用該蛋白檢測沙門菌抗體，可以有效地檢出被沙門菌感染的雞。因此，本試驗(yàn)采用分子克隆方法，得到InvJ蛋白，將其作為檢測抗原，研制出能檢測沙門菌InvJ抗體的間接ELISA方法，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
　　 1.沙門菌InvJ基因的克隆與融合蛋白的表達(dá)同源性分析顯示沙門菌InvJ蛋白和其他細(xì)菌的蛋白同源性低，在沙門菌中是一個(gè)保守蛋白。根

3、據(jù)Genbank(CP003047)上公布的雞傷寒/白痢沙門菌InvJ序列設(shè)計(jì)引物，成功在腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC3375)中擴(kuò)增得到InvJ基因，將該基因連接到pET-28a(+)表達(dá)載體，構(gòu)建融合質(zhì)粒pET-in4，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，成功誘導(dǎo)出融合蛋白。Western-blot結(jié)果顯示該蛋白具有良好的免疫原性。
　　 2.檢測沙門菌InvJ抗體的間接ELISA方法的建立使用純化后的融合蛋白包被酶標(biāo)板

4、，建立間接ELISA方法，經(jīng)試驗(yàn)確定最佳檢測條件:包被濃度為0.17μg/mL，包被液為磷酸鹽緩沖液(20mmol/L，pH7.0)，4℃包被12h，使用5％脫脂奶粉作為封閉液，37℃封閉90min，使用PBST將待檢血清稀釋800倍檢測，血清孵育時(shí)間為45min，二抗孵育時(shí)間45min，顯色時(shí)間為15min，陽性臨界值為0.162。
　　 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示該方法重復(fù)性良好。使用所建方法對(duì)9個(gè)雞場655份血清進(jìn)行了檢測，陽性率