雞鮑氏志賀菌疫苗免疫抗體間接ELISA定量檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、雞鮑氏志賀氏菌病是近年所發(fā)現(xiàn)的雞的一種新發(fā)傳染病,該病是由雞鮑氏志賀氏菌引起的一種急性傳染病,可使不同品種、不同日齡的雞發(fā)生腹瀉,并可引起幼雛大批發(fā)病和死亡。且有關(guān)研究結(jié)果已表明:志賀氏菌可在人禽間造成交互感染。因此,對該病展開研究不但具有重要的獸醫(yī)衛(wèi)生學(xué)意義,而且具有重大的醫(yī)學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究通過建立間接EL,ISA方法,并應(yīng)用于雞鮑氏志賀氏菌滅活疫苗免疫雞血清抗體的檢測,為正確評(píng)價(jià)疫苗免疫效果、制定合理免疫程序、有效預(yù)防和控制

2、本病提供了準(zhǔn)確可靠的血清學(xué)檢測手段和方法。研究結(jié)果如下:
　　 1.間接ELISA方法的建立
　　 本研究以甲醛滅活的雞鮑氏志賀氏菌全菌體為包被抗原,以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗雞IgG為二抗,成功建立了檢測雞鮑氏志賀氏菌滅活疫苗免疫抗體的間接ELISA方法,并確定了ELISA的最佳工作條件:抗原包被濃度為108cfu/ml,最佳包被溫度為4℃12h；最佳封閉條件為1％BSA37℃封閉2h；血清最佳稀釋度為1:1

3、60；二抗最佳稀釋度為1:4000,最佳工作條件為37℃1h:底物最佳工作條件為37℃20min。通過交叉試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)等結(jié)果表明該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。其中板內(nèi)變異系數(shù)0.36％～0.64％,扳間變異系數(shù)為1.05％～1.85％；包被的全菌體抗原與其他腹瀉病原的抗體無交叉反應(yīng),阻斷結(jié)果為陽性；間接ELISA方法靈敏度是微量凝集試驗(yàn)的80-160倍。
　　 分別檢測20份陽性雞血清

4、不同稀釋度的OD值,發(fā)現(xiàn)陽性血清OD值與血清中ELISA效價(jià)倒數(shù)的對數(shù)之間均存在線性相關(guān)性。根據(jù)擬和的標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定回歸方程為:log[ET倒數(shù)]=1.776+1.921x。回歸方程的建立為臨床免疫后根據(jù)血清OD值來預(yù)測和分析抗體水平提供了數(shù)學(xué)模型。
　　 2.間接ELISA方法應(yīng)用于雞鮑氏志賀氏菌滅活疫苗免疫雞血清抗體檢測
　　 為了評(píng)價(jià)雞鮑氏志賀氏菌滅活疫苗的體液免疫效果,應(yīng)用建立的間接ELISA方法對疫苗免疫后的雞

5、血清抗體進(jìn)行檢測,結(jié)果表明免疫組雞群的免疫抗體效價(jià)明顯高于同期的未免疫對照組(p<0.05),二免后的抗體水平明顯高于一免(p<0.05)。雞群在一免后抗體水平迅速升高,第2周即可達(dá)到最高峰,在二免后第9周仍高于一免(p<0.05)。一免后第4周二免組和一免后第6周二免組二者同期抗體水平差異不明顯(p>0.05)。結(jié)果表明,雞鮑氏志賀氏菌滅活疫苗能夠顯著提高機(jī)體的體液免疫功能；所建立的間接ELISA方法能夠準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)雞鮑氏志賀氏菌疫苗的