1型鴨甲肝病毒和鴨坦布蘇病毒液相芯片抗體檢測方法的建立.pdf

1、鴨病毒性肝炎（Duck virus hepatitis,DVH）是危害雛鴨的一種急性、高致死性傳染病，主要侵害3周齡以內(nèi)雛鴨，已在國內(nèi)廣泛流行，嚴重威脅養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。鴨坦布蘇病毒?。―uck tembusu disease）是一種傳播迅速的急性傳染病，可使肉鴨表現(xiàn)神經(jīng)癥狀、產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋量下降等。自2010年在我國爆發(fā)以來，影響范圍廣，已造成巨大經(jīng)濟損失。目前，鴨甲肝病毒(Duck hepatitisA virus,DHAV)和鴨坦布蘇

2、病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)的抗體檢測主要依賴中和試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗，批量檢測樣品時費時費力，因此臨床急需一種高效、快速的檢測方法對多種病原抗體同時進行檢測。
　　VP1基因和E基因分別是鴨甲肝病毒和鴨坦布蘇病毒的主要抗原基因。本試驗將1型鴨甲肝病毒的VP1基因和鴨坦布蘇病毒的E基因分別在BL21（DE3）大腸桿菌中表達，用純化的重組蛋白為抗原建立1型鴨甲肝病毒與鴨坦布蘇病毒的液相芯片抗體檢測方法，

3、為DHA-1和DTMU的快速血清學診斷奠定基礎。本研究主要包括以下三部分內(nèi)容：
　　1.鴨甲肝病毒的分離鑒定及VP1基因序列分析
　　收集2016年山東、河南等地區(qū)發(fā)病鴨場中疑似鴨甲肝病鴨的肝臟組織，共8份，經(jīng)研磨凍融離心處理后接種鴨胚，中和試驗進一步確診。結(jié)果有2株分離毒能被1型鴨甲肝病毒陽性血清中和，有6株分離毒能被3型鴨甲肝病毒陽性血清中和，初步確診分離毒株中有2株為1型鴨甲肝病毒(DHAV-1)，6株為3型鴨甲肝病毒

4、(DHAV-3)。利用設計的特異性引物對1型鴨甲肝病毒和3型鴨甲肝病毒分別進行RT-PCR擴增，將純化的1型VP1基因和3型VP1基因分別克隆至pMD18-T載體中，構(gòu)建pMD18-T-1VP1和pMD18-T-3VP1基因克隆重組質(zhì)粒并測序，利用MegAlign軟件對VP1蛋白的氨基酸同源關系進行比對，結(jié)果顯示：2016年分離的1型鴨甲肝病毒毒株1-JS DH/16株和1-HZYC/16株與經(jīng)典毒株1-R85952/55的同源性分別是

5、93.8％和93.4%，與其他分離毒株的同源性為最低92%~最高94.5%；3型鴨甲肝病毒毒株3-GD/16株、3-HNSQ/16株、3-SDGT/16株、3-SDXD/16、3-SC1/16株和3-SC2/16株與經(jīng)典毒株AP04114/03株的同源性分別為92.1%、92.5%、92.4%、93.5、92.4和92.4%，與其他分離株的同源性為最低90.1%~最高99.7%；利用MEGA4.0生物學軟件進行遺傳進化分析，繪制進化樹，

6、可見：2016年分離毒株1-JSDH/16株和1-HZYC/16株處于同一個分支，與近幾年的流行株1-CS/14株的親緣關系最近，與經(jīng)典毒株1-R85952/55株親緣關系相對較遠；3-GD/16株與3-SC1/16株、3-SC2/16株三者親緣關系最近，處于同一個小分支上，3-SDGT/16株與3-HNSQ/16株的親緣關系近，處于同一分支上，3-SDXD/16株單獨處于一個分支，上述分離株與經(jīng)典毒株3-AP04023/04株的親緣關

7、系較遠。
　　2.pCold-1VP1和pET-28a-E的原核表達
　　將純化的1VP1基因克隆至pCold-III原核表達載體中，篩選獲得含1VP1基因正向插入的、有正確讀碼框的重組質(zhì)粒pCold-1VP1。用NdeI/Hind III進行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測出兩條條帶，分別在4,377bp和714bp左右，與預期大小相符。
　　提取鴨坦布蘇病毒(DTMUV)的RNA，用特異性引物進行RT-PCR擴增，

8、得到1,503bp的 E基因，將純化后的E基因克隆至pMD18-T載體中，構(gòu)建pMD18-T-E重組質(zhì)粒并保存，然后將其插入pET-28a（+）原核表達載體，篩選陽性重組質(zhì)粒pET-28a-E。用EcoR I/XhoI進行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測出兩條條帶，分別在5,285bp和1,503bp左右，與預期大小相符。
　　對獲得重組表達載體pCold-1VP1和pET-28a-E菌液，進行IPTG誘導表達，對表達的重組蛋白進

9、行 SDS-PAGE和Western blot分析（一抗分別為1型鴨甲肝病毒陽性血清和鴨坦布蘇病毒陽性血清）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DHAV-1VP1和DTMUV-E蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中可穩(wěn)定、高效地表達。將表達的重組蛋白純化后均得到單一的蛋白條帶，分別為26.5kDa和54.8kDa，Western blot檢測表明重組蛋白具有良好的免疫原性。
　　3.DHAV-1和DTMUV液相芯片抗體檢測方法的建立
　　根據(jù)液相蛋白