檢測抗偽狂犬病毒抗體膠體金免疫層析方法的建立及初步評價.pdf

1、豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的一種以仔豬致命性腦炎、育肥豬呼吸道癥狀以及母豬的流產(chǎn)為主要臨床表現(xiàn)的豬的傳染病，該病給許多國家的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。雖然，基因缺失疫苗免疫與gE ELISA抗體檢測試劑盒的聯(lián)合應(yīng)用幫助許多國家完成了對該病的凈化，但是，由于野豬是該病病原的宿主庫，仍然會造成臨近豬群的感染，同時，感染后的豬群作為隱性帶毒者，也會成為長期的潛伏傳染源。因此，對于該病的預(yù)防仍然十分重要。
　　目前，國際上廣泛使用gE基

2、因缺失疫苗免疫豬群取得了良好的預(yù)防效果，且疫苗免疫與野毒感染后，動物血清中是否會檢測到抗偽狂犬病毒gE蛋白抗體已經(jīng)被作為鑒別診斷常用的方法。PRV-gE ELISA商品化的試劑盒就常常被用來進(jìn)行DIVA診斷。盡管如此，ELISA方法由于需要特定的儀器、有一定技術(shù)培訓(xùn)的人員在實驗室中才可以完成，無法由無技術(shù)培訓(xùn)的飼養(yǎng)人員或獸醫(yī)直接簡便的在現(xiàn)地做出快速的診斷。因此，本研究通過膠體金免疫層析試驗建立了抗偽狂犬病毒gE抗體的DIVA快速、簡便的

3、檢測方法，并進(jìn)行了初步評價。
　　本實驗通過擴增包含gE蛋白重要表位的部分基因，經(jīng)測序，克隆于原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a，于大腸桿菌表達(dá)菌BL21中誘導(dǎo)、表達(dá)并純化，獲得表達(dá)蛋白，Western-blot結(jié)果表明，表達(dá)蛋白可以與抗PRV陽性血清特異結(jié)合，將純化后的gE表達(dá)蛋白與商品化的豬的IgG分別作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）噴點于硝酸纖維素膜上，以膠體金顆粒標(biāo)記金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)作為示蹤劑，建立了檢測豬血清中抗

4、PRV-gE蛋白抗體的的膠體金免疫層析方法。判定標(biāo)準(zhǔn)為:1）待檢的血清中含有抗PRV-gE抗體，可與金標(biāo)SPA結(jié)合形成IgG-SPA復(fù)合物，經(jīng)層析膜流經(jīng)T線和C線時，IgG-SPA復(fù)合物就會和T線上的PRV-gE蛋白以及C線上的豬的IgG發(fā)生特異性結(jié)合，形成兩條紅色的線，判定為陽性結(jié)果;2）若待檢血清中不含有抗PRV-gE抗體，則只有質(zhì)控線出現(xiàn);3）若出現(xiàn)質(zhì)控線未形成紅色條帶時，則該方法檢測結(jié)果無效。經(jīng)過探索該膠體金得最佳反應(yīng)條件，我們

5、最終確定C線包被豬的IgG、濃度為2mg/ml，T線濃度為2mg/ml，金標(biāo)SPA最佳標(biāo)記pH為8.0、濃度為0.1mg/ml，血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶50倍稀釋。
　　繼而，對本實驗建立的檢測方法分別進(jìn)行了特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性以及符合率的檢驗。結(jié)果表明，該方法特異性良好，只在檢測偽狂犬病毒血清時出現(xiàn)陽性反應(yīng)，對其他病毒血清檢測為陰性例如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒、豬肺支原體、豬流行性腹瀉與傳染性胃腸炎病毒等;對同

6、一批樣品進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗與批間重復(fù)試驗，該方法檢測均為同一結(jié)果，并且在4℃可穩(wěn)定儲存長達(dá)4個月之久不改變其特性;與愛德士偽狂犬gE抗體檢測試劑盒對比，該方法敏感性略高，該方法特異性和敏感性分別為81.6％和90.7％，并且兩者之間有良好的符合性(Kappa=0.7289)。我們又進(jìn)行了豬的攻毒實驗，分別用建立的膠體金免疫層析方法和愛德士ELISA方法對不同的4組（每組7只）豬即非免疫攻毒組、非免疫非攻毒組、免疫攻毒組、免疫非攻毒組豬進(jìn)行