牛D型產(chǎn)氣莢膜梭菌病膠體金免疫層析檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Cl.perfringens）是一種梭狀芽孢屬條件性致病菌，該病廣泛分布于自然界，在一定條件下，可引起嚴(yán)重的犢牛腸毒血癥,甚至死亡。目前針對(duì)該菌導(dǎo)致的疾病尚無(wú)免疫膠體金檢測(cè)方法，因此，本研究目的是運(yùn)用膠體金免疫層析技術(shù)，建立一種快速、靈敏、特異的檢測(cè)牛D型產(chǎn)氣莢膜梭菌病的方法。
　　本試驗(yàn)成功地以Cl.perfringens D型標(biāo)準(zhǔn)株C60-2的菌體抗原用甲醛進(jìn)行滅活后，加弗氏佐劑免疫青年雄家兔制備兔抗牛D型產(chǎn)氣莢

2、膜梭菌多克隆抗體，瓊擴(kuò)檢測(cè)效價(jià)為1:128，經(jīng)辛酸-硫酸銨法粗提，然后再用 HiTrap Protein G HP親和層析法純化后，經(jīng) SDS-PAGE分析主要蛋白帶只有兩條，即重鏈50 KD，輕鏈24 KD。以檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，用25 nm膠體金標(biāo)記多克隆抗體制備金標(biāo)探針，分別以兔抗牛源D型產(chǎn)氣莢膜梭菌IgG和羊抗兔IgG作為硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，組裝膠體金試紙條，并對(duì)試紙條的檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　研究

3、結(jié)果顯示，抗體與膠體金結(jié)合的最佳 pH為8.6，用蛋白濃度梯度法測(cè)定膠體金結(jié)合多克隆抗體最佳結(jié)合濃度是30μg/mL。試紙條操作簡(jiǎn)單，用肉眼15 min內(nèi)可判定結(jié)果，對(duì) D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗原具有高度特異性，與其它血清型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)抗原及其它細(xì)菌沒(méi)有交叉反應(yīng)。試紙條在4℃保存6個(gè)月，其特異性及靈敏度無(wú)明顯變化。上述結(jié)果表明，本研究建立的牛D型產(chǎn)氣莢膜梭菌病膠體金免疫層析檢測(cè)方法具有特異、敏感、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單快捷等特點(diǎn)，適合用于牛D型產(chǎn)