膠體金免疫層析快速檢測氯霉素技術(shù)研究.pdf

1、氯霉素是一種廣譜抗生素，廣泛用于人和動物各種細(xì)菌性疾病的治療，因其毒副作用較強，許多發(fā)達國家相繼禁止或嚴(yán)格限制使用氯霉素，但傳統(tǒng)的氯霉素殘留分析方法需要昂貴的儀器和專業(yè)技術(shù)人員，且周期長、成本高，不能滿足現(xiàn)場和快速檢測的要求。因此，建立高效、靈敏、經(jīng)濟的氯霉素殘留分析方法是很有必要的。膠體金免疫層析試紙條檢測法是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)對微量抗原或抗體進行測定的方法，本論文旨在研制氯霉素免疫膠體金層析試紙條，應(yīng)用于畜產(chǎn)品中氯霉素殘

2、留的快速檢測，具有重要的現(xiàn)實意義和極高的商業(yè)開發(fā)價值。 采用活性酯法和重氮化法，將半抗原氯霉素與小牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，用紫外光譜、紅外光譜、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定偶聯(lián)結(jié)果并計算結(jié)合比。紫外掃描結(jié)果表明通過活性酯法和重氮化法研制的半抗原與BSA，OVA偶聯(lián)物的摩爾消光系數(shù)分別為1.64×10<'5>、49402；3.73×10<'5>、46601，顯著大于半抗原和載體蛋白?；钚怎シㄖ苽涞陌肟乖?/p>

3、與BSA，OVA的偶聯(lián)比分別為12，2；重氮化法制備的半抗原與BSA，OVA的偶聯(lián)比分別為30，1。紅外光譜分析確證了偶聯(lián)成功。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，偶聯(lián)物純度較高。 運用合成的免疫原(Hap-BSA)多次免疫家兔，采集抗血清，制備出氯霉素多克隆抗體。通過競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法證實該抗血清與琥珀氯霉素的交叉反應(yīng)率為180％，與鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、青霉素及克倫特羅等類似物的交叉反應(yīng)率均小于0.01％，對氯霉素的檢出

4、限為0.01μg/L，具有較高的特異性和親和力。 對檸檬酸三鈉還原氯金酸制備的兩種不同粒徑的膠體金進行顏色、紫外掃描曲線和電鏡掃描，結(jié)果表明， 16nm膠體金顆粒可用于標(biāo)記抗體。通過紫外分析和試管觀察試驗確定了膠體金標(biāo)記抗體的最適蛋白質(zhì)濃度為24gg/mL，最適pH為7.6，且利用最低蛋白量和最適pH標(biāo)記抗體制得免疫膠體金，經(jīng)低溫超速離心純化和免疫滲濾檢測，免疫膠體金具有氯霉素特異性。 膠體金墊是把吸光度為5 0D(52

5、0nm紫外掃描)的免疫膠體金均勻涂布于SB08型玻璃膜上，再冷凍干燥后制得。經(jīng)比較試驗選用Millipore公司的HF13504型硝酸纖維素膜作為層析膜；質(zhì)控線采用稀釋10倍的二抗(羊抗兔IgG)；用濃度為0.225mg/mL的氯霉素包被原(CAP-OVA)噴涂檢測線；樣品墊、吸水墊均采用Millipore公司的專用材料。將膠體金墊、層析膜、樣品墊、吸水墊組裝制成免疫層析試紙條。 用制得的免疫層析試紙條檢測已知的含有氯霉素的樣品