膠體金免疫層析法快速定量檢測動物組織中喹乙醇的研究.pdf

1、喹乙醇(Olaquindox)是化學(xué)合成的喹噁啉類廣譜抗菌藥物，作為飼料添加劑可顯著促進動物生長，并可預(yù)防和治療細菌感染性疾病。但研究發(fā)現(xiàn)，喹乙醇具有中等以上的蓄積毒性，使用不當(dāng)會導(dǎo)致動物畸變，癌變甚至死亡，且殘留在動物組織中的喹乙醇對人體健康也有很大的威脅。目前，動物組織中喹乙醇殘留檢測方法主要是色譜法和酶聯(lián)免疫法(ELISA)，但這些方法對操作人員要求較高，耗費時間較長，不易普及。隨著膠體金免疫層析技術(shù)（gold immune ch

2、romatographic assay，GICA）快速診斷試紙條（簡稱膠體金試紙條）的發(fā)展，其因具有檢測簡便快捷、無需檢測儀器，且成本低、無污染等優(yōu)點，已逐漸被應(yīng)用于食品農(nóng)獸藥殘留的監(jiān)測中。本試驗旨在應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)建立動物組織中喹乙醇殘留的快速定量檢測方法。
　　1.喹乙醇多克隆抗體的制備和鑒定。為制備喹乙醇多克隆抗體，采用琥珀酸酐法合成半抗原喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS)，通過活化酯法將半抗原與載體蛋白(BSA和OVA

3、)偶聯(lián)制備喹乙醇免疫原(OLA-HS-BSA)和包被原(OLA-HS-OVA)，利用紫外分光光度法測定其濃度并掃描鑒定;利用制備的免疫原對6周齡BALB/c小鼠免疫以制備多克隆抗體，ELISA法測定多抗血清效價，鑒定抗體敏感性和特異性。結(jié)果顯示，OLA-HS和BSA，OVA的分子結(jié)合比分別為6∶1和6∶1，血清效價達到1∶51200，檢測抗體IC50值為17.4ng/mL，IC20值為3.86ng/mL，與卡巴氧的交叉率為0.53％，與

4、乙酰甲喹，3-甲基-喹噁啉-2-羥酸等藥物幾乎不存在交叉反應(yīng)。
　　2.喹乙醇膠體金免疫層析試紙條的制備。將已制備純化好的喹乙醇多克隆抗體與膠體金結(jié)合產(chǎn)生的金標抗體噴涂在玻璃纖維墊上，并將包被抗原OLA-OVA和羊抗鼠二抗分別結(jié)合在硝酸纖維素膜上，組裝成免疫層析快速檢測試紙條，并檢測試紙條的靈敏度、特異性、準確性和穩(wěn)定性。將制備的試紙條用于檢測豬肉和豬肝樣品，結(jié)果表明本研究制備的試紙條可以在5 min內(nèi)完成檢測，肉眼觀察的最低檢測

5、限為0.05μg/mL，與其結(jié)構(gòu)類似物卡巴氧、乙酰甲喹、3-甲基-喹噁啉-2-羥酸的反應(yīng)交叉性小，該試紙條假陽性率小于5％，假陰性率為0，在干燥常溫條件下保存6個月仍然有效。因此，本試驗研究的檢測方法可應(yīng)用于動物組織中喹乙醇的快速檢測和現(xiàn)場篩查。
　　3.喹乙醇膠體金免疫層析試紙條定量檢測喹乙醇的殘留量和市場應(yīng)用。在膠體金免疫層析基礎(chǔ)上建立了T/C比值法定量檢測動物組織中喹乙醇殘留，檢測結(jié)果與ELISA和高效液相色譜法(HPLC)

6、相比較。當(dāng)組織中喹乙醇質(zhì)量濃度在1～200ng/mL范圍內(nèi)，試紙條有較好的線性關(guān)系，最低檢測限為6.83ng/mL。陰性加標試驗結(jié)果表明，喹乙醇濃度在25，50和100ng/mL時，試紙條的回收率在90.9～105.0％之間，與采用用ELISA法和HPLC法的檢測結(jié)果較一致。
　　總之，本研究所研制的喹乙醇膠體金試紙條具有特異性強、穩(wěn)定性好、靈敏度高等特點，在實際動物組織樣品的喹乙醇殘留檢測中所得到的檢測結(jié)果與ELISA法和HPL