膠體金免疫層析試紙條定量檢測(cè)豬尿以及豬肉中的克倫特羅殘留.pdf

1、免疫層析試紙條定量是一種利用光學(xué)傳感器實(shí)現(xiàn)待測(cè)物快速定量檢測(cè)的分析方法,具有試紙條檢測(cè)的簡(jiǎn)單快速、抗干擾性強(qiáng)及可現(xiàn)場(chǎng)篩查等優(yōu)點(diǎn)。近年來,免疫層析試紙條定量檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道逐年增多,但通過試紙條免疫動(dòng)力學(xué)反應(yīng)探討影響免疫層析試紙條定量因素的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究以克倫特羅為研究對(duì)象,探討了膠體金免疫層析試紙條T/C比值法定量檢測(cè)豬尿及豬肉中克倫特羅殘留的主要影響因素及其可行性。課題研究旨在為建立膠體金免疫層析試紙條定量分析方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

2、及理論依據(jù)。
　　本研究通過三因素三水平正交優(yōu)化試驗(yàn),確定了檢測(cè)克倫特羅膠體金免疫層析試紙條的最佳生產(chǎn)工藝條件:抗體標(biāo)記量為1μg/mL膠體金,10倍濃縮的金標(biāo)抗體噴涂量為3μL/cm結(jié)合墊,NC膜T線克倫特羅人工抗原噴涂濃度為0.5 mg/mL。在此基礎(chǔ)上,建立了試紙條上金標(biāo)抗體與NC膜T線抗原及NC膜C線二抗免疫動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的分析方法,探討了樣品的鹽離子濃度、pH值、環(huán)境溫度及試紙條判讀時(shí)間對(duì)試紙條定量分析的影響。免疫動(dòng)力學(xué)分析

3、結(jié)果表明,T/C比值法可有效縮短定量分析的檢測(cè)時(shí)間(T/C比值進(jìn)入穩(wěn)定期僅需10 min);T/C比值法在一定范圍內(nèi)可消除環(huán)境溫度對(duì)定量分析結(jié)果的影響(10~37℃);樣品基質(zhì)中(尿樣)鹽離子濃度(0~0.5 mol/L)對(duì)試紙條的T/C比值影響較小;尿樣的pH在6~9之間,試紙條T/C比值比較穩(wěn)定,pH≤5時(shí)試紙條T/C比值下降顯著。以混合陰性尿樣為基質(zhì),擬合了試紙條定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線,即當(dāng)尿液中克倫特羅濃度在0.1~2.0 ng/mL

4、范圍內(nèi),膠體金試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的線性,50％抑制濃度(IC50)達(dá)到0.36 ng/mL(n=5)。該試紙條檢測(cè)實(shí)際尿樣中克倫特羅的最低檢測(cè)限為0.22 ng/mL。試紙條的批內(nèi)和批間檢測(cè)的變異系數(shù)均小于10%。采用試紙條和商業(yè)化ELISA試劑盒同時(shí)分析50份陰性加標(biāo)樣品,結(jié)果顯示兩種方法具有較好的線性相關(guān)性(R2=0.96)。進(jìn)一步對(duì)90個(gè)不同來源的加標(biāo)豬尿樣品進(jìn)行分析,96%的樣品回收率在70%~130%之間。以上結(jié)果表明,本

5、研究建立的免疫層析試紙定量方法可用于豬尿中克倫特羅的定量分析,且大大提高了試紙條的檢測(cè)靈敏度,拓寬了試紙條現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的適用范圍。
　　同時(shí),建立了膠體金試紙條定量檢測(cè)豬肉中克倫特羅的方法。比較了5種豬肉樣本中簡(jiǎn)便提取克倫特羅的回收率差異,結(jié)果顯示采用0.02 mol/L,含2.8%NaCl的HCl溶液抽提豬肉樣品2次,克倫特羅提取得率76.7%,變異系數(shù)為7.4%。其結(jié)果基本滿足基層實(shí)驗(yàn)室快速篩查檢測(cè)的需求。試紙條定量檢測(cè)豬肉中克倫

6、特羅的線性范圍為0.1~1.5 ng/g,最低靈敏度為0.19 ng/g。實(shí)際豬肉樣本加標(biāo)(0.5 ng/g、1.0 ng/g、2.0 ng/g及3.0 ng/g)回收實(shí)驗(yàn)顯示,回收率分別為60.4±12.8%,70.24±4.2%,75.9±4.9%,71.1±5.0%。與傳統(tǒng)ELISA方法比對(duì),顯示兩種方法具有較好的相關(guān)性(R2=0.91)。
　　本試驗(yàn)進(jìn)一步采用生物素-鏈霉親和素體系制備了克倫特羅免疫磁珠,建立了豬肉中克倫特

7、羅親和純化的前處理方法。通過條件優(yōu)化,免疫磁珠最佳制備工藝如下:將1 mg鏈霉親和素(SA)磁珠(含23.9μg SA)與220μg生物素化抗體反應(yīng),最終每毫克磁珠表面抗體偶聯(lián)量為77.2μg。采用免疫磁珠凈化豬肉中克倫特羅的最佳條件如下:將4 mL HCl溶液(0.15 mol/L)與1 g豬肉勻漿樣品混合,在劇烈震蕩條件下提取5~10 min;16000 rpm離心5 min;上清液中加入0.25 mg免疫磁珠吸附,磁力架分離磁珠;