快速檢測豬肉中大腸桿菌O157-H7膠體金免疫層析試紙條的研究.pdf

1、大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）是一種高致病性的食源性致病菌，10個(gè)細(xì)菌就能致病，它能引起人類急性腹瀉、嘔吐、高燒和敗血癥等疾病，因此，快速而準(zhǔn)確地檢測大腸桿菌O157:H7具有重要意義。傳統(tǒng)的大腸桿菌O157:H7檢測方法時(shí)間較長，因此，研制快速檢測大腸桿菌O157:H7的方法對于應(yīng)急檢測而已是必要的。我國是豬肉食用大國，因此防控豬肉中的大腸桿菌O157:H7污染對我國來說尤為重要。本文致力于

2、建立一種適用于基層的快速檢測豬肉中大腸桿菌O157:H7的膠體金免疫層析方法。
　　本文對快速檢測大腸桿菌O157:H7膠體金免疫層析試紙條的穩(wěn)定性、靈敏度、特異性進(jìn)行評價(jià)后，將其應(yīng)用于豬肉檢測。當(dāng)使用中國標(biāo)準(zhǔn)前增菌方法對豬肉進(jìn)行前增菌培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)無論是在本實(shí)驗(yàn)制備的試紙條上還是在杜邦公司商品化的試紙條上，對大腸桿菌O157:H7陰性肉樣的檢測頻繁地出現(xiàn)假陽性，從這些假陽性肉樣中篩選出了一株弗氏檸檬酸桿菌，查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知，某些弗

3、氏檸檬酸桿菌和大腸桿菌O157:H7表面有相似的O157抗原，因此使用免疫學(xué)方法檢測時(shí)極易發(fā)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。本文通過改進(jìn)前增菌培養(yǎng)基配方（改良的麥康凱肉湯培養(yǎng)基），優(yōu)化其添加的添加劑濃度（噻孢霉素濃度為0.1mg/L，亞碲酸鉀濃度為5mg/L），防止假陽性反應(yīng)的發(fā)生。將此培養(yǎng)基用于培養(yǎng)豬肉樣品后，使用膠體金試紙條進(jìn)行檢測。2CFU/g大腸桿菌O157:H7污染的豬肉檢出率為100％，同時(shí)一定程度的消除了弗氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致的假陽

4、性反應(yīng)。證明本文研究的方法適用于豬肉中大腸桿菌O157:H7的檢測。
　　在傳統(tǒng)試紙條的基礎(chǔ)上，本文研究了一種大腸桿菌O157:H7雙金新型免疫層析試紙條，可以有效地提高大腸桿菌O157:H7的檢測靈敏度。膠體金免疫層析試紙條T線上包被兔抗大腸桿菌O157:H7多抗，C線上包被抗鼠二抗。膠體金標(biāo)記抗鼠二抗后，與另一膠體金標(biāo)記的抗大腸桿菌O157:H7單抗結(jié)合，因此在試紙條的檢測線上就有兩種不同的膠體金顆粒，起到增強(qiáng)顯色信號的目的。

5、本文研究了兩種模式的信號放大試紙條。一類為直接信號放大法，將金標(biāo)單抗固定在金墊上，與金標(biāo)抗鼠二抗充分混合的樣品液加入到試紙條上進(jìn)行反應(yīng)。另一類是間接信號放大法，將金標(biāo)單抗與樣品液充分混合，反應(yīng)3min后，再加入金標(biāo)抗鼠二抗混勻，加入到試紙條上反應(yīng)。對金標(biāo)大腸桿菌O157:H7單抗和金標(biāo)抗鼠二抗的兩種膠體金的粒徑進(jìn)行系統(tǒng)性研究，結(jié)果顯示，使用28nm金標(biāo)抗大腸桿菌O157:H7單抗和45nm金標(biāo)抗鼠二抗相互作用時(shí)，可以將大腸桿菌O157: