免疫膠體金技術(shù)快速檢測大腸桿菌O157和志賀毒素.pdf

1、大腸桿菌O157是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga-producing Escherichia coli，STEC）的主要血清型，可以引起人和動(dòng)物的腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合征、血栓性血小板減少性紫癜。志賀毒素（Shiga toxin，Stxs）是大腸桿菌O157的主要毒力因子之一，有兩個(gè)生物型：Stx1和Stx2，只產(chǎn)生Stx2的菌株毒力比只分泌Stx1和兩者同時(shí)分泌的菌株毒力都強(qiáng)。Stx2致病劑量極低，且分泌胞外，Stx2的檢

2、測將直接有助于對分離菌株致病力強(qiáng)弱的判定，提高對高致病性大腸桿菌O157菌株的檢出。因此本課題研究大腸桿菌O157和Stx2的膠體金層析法(Gold ImmunochromatographyAssay，GICA)，進(jìn)行高致病性大腸桿菌O157菌株檢測和鑒定，以便更好的預(yù)防和控制大腸桿菌O157所致的人和動(dòng)物的疾病。 將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組Stx2B亞單位的質(zhì)粒pGEX-Stx2B轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，然后采用PCR和酶切進(jìn)行鑒定

3、，將陽性轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)、鑒定、純化，用純化的融合蛋白多次免疫新西蘭大白兔制備抗重組Stx2B的多克隆抗體。同時(shí)用大腸桿菌O157 ATCC43889全菌體抗原多次免疫新西蘭大白兔，制備抗大腸桿菌O157多克隆抗體。 用硫酸胺法、辛酸-硫酸胺法、Protein G親和層析3種方法分別純化制備的多克隆抗體，結(jié)果表明：Protein G法純化的抗重組Stx2B IgG純度較其前兩者純，其金標(biāo)多抗的穩(wěn)定性較好，辛酸-硫酸胺法純

4、化的抗大腸桿菌O157 IgG的活性較Protein G純化的好，其金標(biāo)多抗的穩(wěn)定性較好，因此本試驗(yàn)采用Protein G法純化抗Stx2B血清，用辛酸-硫酸胺法純化抗大腸桿菌O157血清。根據(jù)試紙條的側(cè)向流動(dòng)和膠體金的示蹤功能，結(jié)合免疫學(xué)原理，分別建立并優(yōu)化了檢測大腸桿菌O157和Stx2的雙抗體夾心免疫膠體金方法。測定了膠體金顆粒的最優(yōu)化反應(yīng)體系：膠體金顆粒的大小為20nm；抗體與膠體金溶液結(jié)合的最佳pH約為8.2；最佳蛋白結(jié)合量分

5、別為抗大腸桿菌O157 IgG為57μg/mL，抗重組Stx2B IgG為60μg/mL；最佳穩(wěn)定劑為BSA；最佳緩沖液為pH8.2硼酸溶液；最佳金標(biāo)保存液和洗滌液為5mM NaCl-1％BSA的pH 8.2的硼酸緩沖液；NC膜的封閉液為3 ％BSA的0.01mol/L PBST；Stx2試紙條和大腸桿菌O157試紙條的質(zhì)控線（C線）上的羊抗兔IgG的多克隆抗體最佳點(diǎn)樣量均為1μg，其檢測線（T線）的抗Stx2的單克隆抗體的點(diǎn)樣量為0.

6、1μg、抗大腸桿菌O157的單克隆抗體的點(diǎn)樣量為1μg，結(jié)合墊上的金標(biāo)抗大腸桿菌O157和重組Stx2B多克隆抗體點(diǎn)樣量均為3μg。用已建立的大腸桿菌O157免疫層析法對實(shí)驗(yàn)室保存的58株已鑒定的菌株進(jìn)行檢測，與血清凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較，其陽性檢出率的符合率達(dá)87.5％，檢測下限為105CFU/mL，顯色時(shí)間為3～5分鐘，陽性檢出率的批內(nèi)平均變異系數(shù)為2.1％，陽性檢出率的批間平均變異系數(shù)為6.9％。用已建立的Stx2免疫層析法對實(shí)驗(yàn)室保