江蘇地區(qū)豬、禽源大腸桿菌O157的生物學(xué)特性分析及飼料中大腸桿菌O157：H7雙重PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是一種重要的人獸共患的食源性致病菌，O157為其最主要的血清型。人感染該病原，可導(dǎo)致腹瀉，出血性腸炎(Hemorrhagic colitis，HC)、血栓形成性血小板減少性紫癜(Thromboticthrombocytopenic purpura，TTP)和溶血性尿毒綜合癥(Hemolytic uremic syndrome，HUS)等疾病

2、的發(fā)生，病死率高達(dá)30％以上。自從1982年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，相繼在英國(guó)、德國(guó)、日本、加拿大、澳大利亞以及國(guó)內(nèi)十幾個(gè)省內(nèi)均引起過(guò)爆發(fā)或分離到過(guò)該菌，嚴(yán)重影響食品安全和公共衛(wèi)生安全。
　　大腸桿菌O157可引起牛、豬，雞等家畜家禽腹瀉疾病的爆發(fā)，影響家畜家禽的生產(chǎn)性能及其產(chǎn)品的質(zhì)量，阻礙養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。研究表明，牛、羊、豬、禽等動(dòng)物及其糞便是大腸桿菌O157的儲(chǔ)庫(kù)，可以通過(guò)各種方式污染食品。人類(lèi)食用污染的食品后而引發(fā)出血性腸炎和溶血

3、性尿毒綜合癥，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。因此，本研究通過(guò)分析江蘇地區(qū)腸出血性大腸桿菌O157分離株的毒力基因、耐藥性、生物被膜形成能力和進(jìn)化分群，有利于更深入了解大腸桿菌O157的流行情況，為江蘇地區(qū)防控大腸桿菌O157感染提供基礎(chǔ)。
　　飼喂污染大腸桿菌O157∶H7的飼料是引起動(dòng)物發(fā)病的重要途徑之一，在我國(guó)疫區(qū)家禽和家畜廣泛攜帶大腸桿菌O157∶H7，由此引起動(dòng)物發(fā)病，甚至造成對(duì)食品的污染。我國(guó)目前采用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法檢測(cè)飼料中腸出血

4、性大腸桿菌O157∶H7，耗時(shí)較長(zhǎng)，費(fèi)用較高，而且檢出率較低。因此，針對(duì)飼料中污染大腸桿菌EHEC O157建立快速、敏感、有效的檢測(cè)方法非常必要。本研究針對(duì)EHEC O157∶H7的O抗原和H抗原的特異性編碼基因rfbE和fliC分別設(shè)計(jì)了引物，建立雙重PCR方法，為快速檢測(cè)飼料中污染大腸桿菌O157∶H7奠定基礎(chǔ)。
　　1.江蘇地區(qū)豬、禽源大腸桿菌O157的生物學(xué)特性分析
　　為了解江蘇省養(yǎng)殖場(chǎng)中豬、禽源大腸桿菌O157

5、的流行情況，在江蘇省收集江蘇地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬、雞糞便及豬肉、雞肉樣品700份，經(jīng)顯色培養(yǎng)基篩選、PCR分離鑒定大腸桿菌O157，并分析其進(jìn)化分群、毒力基因、生物被膜形成能力、耐藥性和耐藥基因，了解O157污染情況。分離得到16株大腸桿菌O157，在糞便和肉中的分離率為2.6(13/500)和1.5％(3/200)，進(jìn)化分群顯示D群為優(yōu)勢(shì)分群，68.75％(11/16)分離株能形成生物被膜。毒力基因stx1、stx2、hlyA、ea

6、e的分布率為25％、37.5％、68.75％、63.16％。綜合分析顯示，不同來(lái)源菌株進(jìn)化分群及毒力基因型相似。分離株的耐藥率在56％以上，且至少同時(shí)耐受7種藥物;耐藥基因tetA、TEM、 floR、cmlA、aph3、aadA1、aadA2檢測(cè)率50％～63％,其它耐藥基因檢測(cè)率小于30％。本研究表明動(dòng)物糞便作為大腸桿菌O157的貯庫(kù)，可能由養(yǎng)殖場(chǎng)感染動(dòng)物并污染肉產(chǎn)品，威脅人類(lèi)健康。
　　2.飼料中大腸桿菌O157∶H7的PC

7、R檢測(cè)方法的研究
　　根據(jù)大腸桿菌O157∶H7的O抗原和H抗原的特異性編碼基因rfbE和fliC分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，建立針對(duì)飼料中污染大腸桿菌O157∶H7雙重PCR的鑒定方法。結(jié)果表明，建立的PCR方法能夠特異性擴(kuò)增出目的條帶。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明雙重PCR方法的敏感性100CFU細(xì)菌。通過(guò)人工污染大腸桿菌O157∶H7飼料樣品，然后利用雙重PCR進(jìn)行檢測(cè)，表明本研究建立的PCR方法可以有效地檢測(cè)飼料中污染的大腸桿菌O157∶H