大腸桿菌O157：H7雞卵黃抗體（IgY）的酶標(biāo)與ELISA檢測方法建立.pdf

1、腸出血性大腸桿菌E．coli O157：H7的傳播與流行已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。本課題通過對E．coli O157：H7特征抗原分離提取及雞體免疫，獲得特異性雞卵黃免疫球蛋白(IgY)；并進(jìn)一步研究IgY的酶(HRP)標(biāo)記方法，建立檢測E．coli O157：H7的免疫學(xué)方法。 E．coli O157：H7的抗原分離與雞體免疫。菌種經(jīng)鑒定后，采用熱酚水法提取菌體脂多糖(LipopoLyrsaccharide，L

2、PS)，進(jìn)一步酸解得到O-特異性多糖抗原(O-specific poLysaccharide O-SP)。10.4g濕菌體可獲得純化LPS12.5mg，產(chǎn)率為0.12％(w/w)，LPS樣品的內(nèi)毒素活性為166.67EU/mg，有強(qiáng)凝集活性。以制得的3種物質(zhì)：LPS、O-SP、E．coliO157：H7菌體抗原(加熱滅活法制備)作為免疫原，分別免疫產(chǎn)蛋雞，收集免疫后的高免雞蛋。 特異性IgY的制備與特性研究。對以上3種免疫原產(chǎn)生

3、的高免雞卵黃，采用水稀釋法，經(jīng)過膜過濾、鹽析、DEAE-Sephadex A-50離子交換色譜等步驟，得到純化IgY樣品(anti-LPS IgY、anti-O-SP IgY、anti-OH IgY)，其純度為79.6～85.3％，ELISA效價(jià)1：800 ～1：1600(稀釋起始濃度均為100μg/ml)，抗體提取率74％～77％。采用劑量——反應(yīng)曲線法測得3種IgY的抗體親和力排序?yàn)椋篴nti-OH IgY>anti-LPS IgY

4、>anti-O-SP IgY；通過交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)得到3種抗體特異性排序?yàn)椋篴nti-O-SP IgY>anti-LPS IgY>anti-OH IgY。 IgY的酶標(biāo)記工藝研究。選用HRP(辣根過氧化物酶)以不同方法標(biāo)記抗E．coli O157：H7特異性抗體anti-O-SP IgY；其中過碘酸鈉氧化法較戊二醛二步法的酶結(jié)合率、標(biāo)記率高，克分子比值合適，而且酶標(biāo)抗體的酶活性與免疫反應(yīng)性均高出后者，所以過碘酸鈉氧化法是HRP更可取

5、的IgY標(biāo)記方法；而在過碘酸鈉氧化法中當(dāng)反應(yīng)體系中HRP與IgY的分子個(gè)數(shù)比為3：1時(shí)，標(biāo)記效果最好(克分子比值1.25，結(jié)合率37.6％，標(biāo)記率43.5％)，所制得的酶標(biāo)抗體的效價(jià)也最高(1：640，酶標(biāo)抗體起始濃度1mg/mL)。雙抗夾心ELISA檢測方法的建立。確定了包被抗體最佳濃度(anti-LPSIgY 1：80)、酶標(biāo)抗體最佳工作濃度(anti-O-SP IgY-HRP 1：160)、酶標(biāo)板的處理程序(40W紫外燈管距離微量

6、板lOcm，照射20min)、封閉液及封閉時(shí)間(1％BSA．的PBST，封閉3h)、酶標(biāo)杭體稀釋液及酶標(biāo)杭體作用時(shí)間(PBST-1％BSA-4％PEG6000，作用時(shí)間為60min)、底物最佳反應(yīng)時(shí)間(25min，37℃)等對夾心ELISA檢測效果有重要影響的實(shí)驗(yàn)因素，完成了檢測Ecoli O157：H7雙抗體夾心ELISA方法的優(yōu)化。經(jīng)交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、敏感性實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)證明本課題建立的夾心ELISA最低檢出量為10<'4>CFU/m