快速檢測大腸桿菌O157-H7膠體金免疫層析方法的建立.pdf

1、大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是引起出血性腸炎和溶血性尿路綜合癥的主要致病菌。牛肉、奶制品、蔬菜等食物是其主要傳播途徑,除此之外,動(dòng)物和人、人和人的接觸也可能導(dǎo)致大腸桿菌O157:H7感染。由于其感染發(fā)病快、死亡率高,嚴(yán)重影響了人民的身體健康。因此,快速診斷大腸桿菌O157:H7具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文旨在建立快速、特異性強(qiáng)、適用于大量樣品和現(xiàn)場檢測的大腸桿菌O157:H7膠體金免疫層析方法。

2、
　　 本文采用全菌抗原和細(xì)胞碎片抗原分別免疫日本大耳兔,制備了抗大腸桿菌O157:H7多克隆抗體。獲得的多克隆抗體效價(jià)達(dá)106。分別用辛酸-硫酸銨法和磁珠吸附法對多克隆抗體進(jìn)行純化,純化后的抗體通過SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分析,并用斑點(diǎn)雜交對純化后的抗體進(jìn)行特異性分析。結(jié)果顯示,辛酸-硫酸銨法純化后的抗體仍有較多的雜蛋白,而磁珠吸附法能有效去除這些雜蛋白,得到較純的抗體。純化后的多克隆抗體均與其它一些細(xì)菌有交叉反應(yīng)。
　

3、　 本文采用膠體金標(biāo)記商品化的單克隆抗體,通過把多克隆抗體和驢抗鼠抗體(二抗)噴涂于硝酸纖維素膜分別作為檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線),研制了大腸桿菌O157:H7膠體金快速檢測試紙條,并對其進(jìn)行了評價(jià)。通過實(shí)驗(yàn),確定了試紙條工藝條件如下:標(biāo)記pH為8.0、蛋白標(biāo)記量為25μg／mL、金標(biāo)抗體離心轉(zhuǎn)速為4000 r／min、膠體金封閉劑為PEG20000、T線噴涂濃度為1 mg／mL、C線噴涂濃度為1.5 mg／mL。用純培養(yǎng)細(xì)菌對試

4、紙條的靈敏度和特異性進(jìn)行了評價(jià),結(jié)果顯示試紙條的靈敏度為105個(gè)細(xì)胞／mL,試紙條除與金黃色葡萄球菌(CMCC26003)和鼠傷寒沙門氏菌(ATCC13311)有弱陽性反應(yīng)外,與其它24株常見的細(xì)菌無交叉反應(yīng)。37℃加速保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本試紙條常溫保質(zhì)期在15個(gè)月以上。在25 g牛肉或萵苣樣品中添加10～100 CFU的目的菌,37℃增菌6 h后,試紙條檢測為陽性結(jié)果。
　　 為了進(jìn)一步提高試紙條的特異性和靈敏度,本文采用提取