膠體金免疫層析法快速檢驗(yàn)醋酸甲孕酮.pdf

1、醋酸甲孕酮（Medroxyprogesterone Acetate，MPA）是一種人工合成的激素，在畜牧生產(chǎn)中，曾被用作動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑。由于醋酸甲孕酮有致乳腺癌的作用，我國(guó)和歐盟已禁止在動(dòng)物性食品生產(chǎn)中使用該藥物。目前檢測(cè)醋酸甲孕酮的方法主要有色譜法和ELISA法，但這些方法操作復(fù)雜，需要專門的儀器設(shè)備，不適合在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速檢測(cè)。本研究旨在應(yīng)用膠體金免疫層析原理，研制醋酸甲孕酮快速診斷試紙條。 本文采用0-（羧甲基）羥胺法合成醋

2、酸甲孕酮-3-(O-羧甲基)肟，琥珀酸酐法合成琥珀酰甲孕酮。研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酰甲孕酮的合成需要24小時(shí)高溫回流，且生成的產(chǎn)物量少；醋酸甲孕酮-3-(O-羧甲基)肟的合成只需在室溫下攪拌3小時(shí)，且生成的產(chǎn)物量多。采用混合酸酐法和EDC法分別將醋酸甲孕酮-3-(O-羧甲基)肟與KLH和BSA偶聯(lián)合成人工完全免疫原和包被抗原，紫外分光光度計(jì)鑒定表明偶聯(lián)成功，并測(cè)得偶聯(lián)比分別為2029:1和43:1。用MPS－KLH免疫三只新西蘭家兔，獲得抗MP

3、A多克隆抗體，親和純化后，間接ELISA測(cè)定效價(jià)達(dá)到1：64000。采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定抗體與MPA的親和性，結(jié)果表明MPA能與所得抗體特異性反應(yīng)，且競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)果明顯。 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，結(jié)果表明，加入還原劑后最佳反應(yīng)時(shí)間為6min，反應(yīng)過(guò)程中攪拌速度為1000rpm。經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)鑒定制備的金顆粒直徑在40nm左右，滿足試紙條檢測(cè)的要求。用制備的膠體金標(biāo)記MPA多克隆抗體，經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)鑒定發(fā)現(xiàn)膠體金

4、最大吸收峰波長(zhǎng)在標(biāo)記前后發(fā)生移位，表明標(biāo)記成功。將MPA金標(biāo)抗體包被在膠體金結(jié)合墊上，MPS-BSA抗原和羊抗兔IgG二抗包被在硝酸纖維膜上，其中MPS-BSA作為檢測(cè)線，羊抗兔IgG二抗作為質(zhì)控線，制備醋酸甲孕酮快速檢測(cè)試紙條。 通過(guò)方陣實(shí)驗(yàn)對(duì)金標(biāo)抗體濃度和抗原濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：當(dāng)采用Millipore公司型號(hào)為M135的硝酸纖維膜，抗原、MPA金標(biāo)抗體濃度分別為1mg/mL和0.5μg /mL時(shí)，其檢測(cè)靈敏度為0.1