豬偽狂犬病毒gE抗體檢測(cè)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法和金標(biāo)免疫層析法的建立及應(yīng)用.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀一種高度接觸性傳染病。目前，針對(duì)國(guó)內(nèi)廣泛使用PRVgE基因缺失苗進(jìn)行接種免疫，通過(guò)檢測(cè)gE抗體即可區(qū)分出疫苗株和野毒株。
　　 本研究利用特異性引物從重組質(zhì)粒pMD-2E8ScFv和pMD-gE中PCR擴(kuò)增出2E8基因（抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體基因）和kgE基因(P

2、RVgE主要抗原編碼區(qū))，采用重疊延伸(SOE) PCR法拼接成融合的雙功能分子2E8kgE，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切，純化后，克隆至BamH1和EcoRI雙酶切的表達(dá)載體pET-Trx中，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-Trx-2E8kgE;將pET-Trx-2E8kgE轉(zhuǎn)化至BL21plysS中，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)具有雙功能的融合蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)；結(jié)果表明，重組菌BL21plysS表達(dá)出約6

3、0.1kD的目的蛋白，與豬偽狂犬病陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)證實(shí)，2E8kgE融合蛋白既能夠與人紅細(xì)胞結(jié)合，又能夠與PRV抗體反應(yīng)，具有雙功能特性。
　　 以純化的抗人紅細(xì)胞單鏈抗體(ScFv)—豬偽狂犬病毒(PRV)gE蛋白雙功能融合蛋白為抗原，建立了檢測(cè)PRV gE抗體的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法：利用方陣滴定試驗(yàn)篩選出最佳抗原工作濃度為55μg/mL，血清最佳稀釋度為1：20，作用時(shí)間30min，與豬瘟(CSF)、豬細(xì)

4、小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、豬乙型腦炎（JE）、豬布氏桿菌病(Brucellosis)陽(yáng)性血清和PRV gE缺失疫苗接種的豬免疫血清均不發(fā)生反應(yīng)，與PRV陽(yáng)性血清反應(yīng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集圈。與美國(guó)進(jìn)口的PRV抗體檢測(cè)gE-ELISA診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較，50份豬血清的陰、陽(yáng)性檢出符合率均為100％。紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法具有敏感性和特異性較高的特點(diǎn)。
　　 與此同時(shí)，該研究以金標(biāo)免疫層析法為基礎(chǔ)，以融合蛋白

5、為診斷抗原和膠體金標(biāo)記物，以羊抗豬IgG包被硝酸纖維膜作為質(zhì)控帶，制備了PRVgE抗體檢測(cè)膠體金試紙條。利用方陣滴定試驗(yàn)篩選出金標(biāo)抗原最佳工作濃度為17.6μg，檢測(cè)線診斷抗原最佳標(biāo)記量為1.76μg，血清最佳稀釋度為1：10，作用時(shí)間15min，與豬瘟(CSF)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、豬乙型腦炎（JE）、豬布氏桿菌病(Brucellosis)陽(yáng)性血清和PRV gE缺失疫苗接種的豬免疫血清檢測(cè)線均不出現(xiàn)紅