豬偽狂犬病毒糖蛋白B細(xì)胞表位編碼序列的克隆及融合表達(dá).pdf

1、豬偽狂犬?。╬orcine pseudorabies PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的、嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病之一。該病毒屬于皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科，線性雙鏈DNA病毒，基因組DNA G+C含量高達(dá)72％，編碼70-100種蛋白。目前已知的編碼糖蛋白有11種，其中 gB、gC、gD糖蛋白，在病毒與宿主細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮著重要的功能。
　　gB、gC、gD糖蛋白均為囊

2、膜蛋白，廣泛分布于病毒顆粒的囊膜表面，不同皰疹病毒的gB、gC、gD糖蛋白基本一致，具有高度保守性。gB、gC、gD糖蛋白均具有多個(gè)空間表位和線性表位，每種蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體均能單獨(dú)能中和病毒，阻止病毒對(duì)細(xì)胞的感染。gB、gC、gD糖蛋白的優(yōu)勢(shì)空間表位和線性表位，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體，gB、gC或 gD蛋白的亞單位疫苗均可保護(hù)小鼠或豬免受 PRV感染，具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，是構(gòu)建重組 DNA疫苗和疫苗免疫檢測(cè)的首選蛋

3、白。
　　本研究以臨床分離的 PRV流行毒株做為研究材料，對(duì) PRV病毒進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，提取病毒DNA。依據(jù)Genbank中PRV gB、gC、gD蛋白B細(xì)胞表位編碼序列，利用融合PCR技術(shù)，分別設(shè)計(jì)gB、gC、gD蛋白B細(xì)胞表位編碼序列融合擴(kuò)增引物，將 gB、gC、gD蛋白 B細(xì)胞表位編碼序列有機(jī)的融合為 gB-C-M、gB-C-N、gB-D表位編碼序列，將gB-C-M、gB-C-N、gB-D表位編碼序列分別克隆于 PMD19-

4、T載體中，構(gòu)建質(zhì)粒 PMD19-T-gB-C-M、PMD19-T-gB-C-N、PMD19-T-gB-D。應(yīng)用 BamHI和 HindIII限制性?xún)?nèi)切酶酶切上述克隆載體，瓊脂糖電泳回收酶切產(chǎn)物，并將其克隆于PET-28a表達(dá)載體，將構(gòu)建的重組載體進(jìn)行酶切鑒定，并對(duì)插入片段進(jìn)行序列測(cè)定和分析，成功構(gòu)建了 pET-28-gB-C-M、pET-28-gB-C-N、pET-28-gB-D表達(dá)載體。分別挑取含有上述表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)