偽狂犬病檢測(cè)方法

1、、偽狂犬病檢測(cè)方法偽狂犬病病毒分 別鑒定1材料預(yù)備DMEM培育基、BHK-21細(xì)胞、新生犢牛血清、青霉素、鏈霉素溶液、0.22ul 微孔濾膜、細(xì)胞培育瓶、C02培育箱、倒置顯微鏡。溶液配制見附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的 附錄) 2操作步驟病料的采集 對(duì)于剛死亡或活體送檢并處死的動(dòng)物，無菌實(shí)行肝、脾、肺、 腎及其腦組織，尤其是三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球，4℃送試驗(yàn)室檢測(cè)。2.1 2.1 樣品處理待檢組織在滅菌乳缽內(nèi)剪碎，加入滅菌玻璃砂研磨，用滅菌生 理鹽水或D

2、ME培育基制成1： 5乳劑，一7()℃反復(fù)凍融后，經(jīng)3()()()rpm離心30 分鐘后，取上清液經(jīng)0.2211 m微孔濾膜過濾后，加入青鏈霉素溶液至最終濃度為 100U/mL, —70℃保存作為接種材料。2.2 2.2 病料接種 將病料濾液接種已長成單層的BHK-21細(xì)胞，接種量為培育基 量的10%, 37c恒溫箱中吸附1小時(shí)后，加入含10%新生犢牛血清(經(jīng)過56℃ 水浴滅活30分鐘，過濾除菌，無支原體)的DMEM培育基，置37c溫

3、箱中培 育。2.3 2.3 觀看結(jié)果 接種后24—48小時(shí)，BHK-21細(xì)胞應(yīng)消失典型的細(xì)胞病變效應(yīng) (Cyto pathogenic effect, CPE),表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，脫落。如第一次接種不消失 CPE,應(yīng)將細(xì)胞培育物凍融后盲傳三代，如仍無CPE,那么判為偽狂犬病病毒陰性。 2.5 2.5病毒的鑒定 將消失CPE的細(xì)胞培育物反復(fù)凍融后，用聚合酶鏈?zhǔn)椒错?、?光抗體試驗(yàn)等兩種方法中任一方法作進(jìn)一步鑒定。偽狂犬病聚合酶鏈?zhǔn)椒错?材料

4、預(yù)備:待檢組織、組織勻漿器、蛋白酶K,十二烷基磺酸鈉(SDS),苯酚、 氯仿，異戊醇(分析純)、TEN緩沖液。溶液配制見附錄C(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)引物：擴(kuò)增偽狂犬病病毒基因中434—651bp之間217bp基因片段，由上海 生物工程公司合成。序歹U為，上游弓I物 Pl： 5LCAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3“ 下游弓I物 P2： 5LGTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 儀器設(shè)施有：凝膠電泳紫外線檢測(cè)儀，PCR擴(kuò)增儀

5、，電泳儀2操作步驟：2. 1.樣品的采集：對(duì)于病死或撲殺動(dòng)物，取腦組織；對(duì)于待檢活豬，用已滅菌 的棉簽，伸入豬鼻腔中，實(shí)行鼻粘液，即為鼻拭子，冷藏條件送試驗(yàn)室檢測(cè)。2.2樣品處理 所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5用TEN緩沖液懸浮收 集于離心管內(nèi)，-70C反復(fù)凍融3次，7000r/min離心5min,如樣品為鼻試子，那么 加入2nli TEN緩沖液，充分?jǐn)D壓，取出棉簽，7000rpm,離心5分鐘，取上清液。 取上清液472.5

6、口 1,加入25 口 1 10%SDS和2.5U1的20mg/ml蛋白酶K, 50℃水 浴搖床上放置2h后加入等量的飽和酚500 u 1,渦旋20s。離心取上清液，加等 量的酚：氯仿：異戍醇(25:24:1)抽提一次，再用氯仿：異戍醇(24： 1)抽提 一次，最終用乙醇沉淀，真空抽干后加入20U1雙蒸水溶解，-20C貯存?zhèn)溆谩Ｎ?、結(jié)果陽性比照的平均值(PCx)與陰性比照的平均值(NCx)之差(P-N)大于或等于0.3 時(shí)試驗(yàn)方成立。2.

7、 3. PCR的操作程序 先將制備的模板DNA置100C水浴10分鐘作變性處理，， 然后馬上放于冰浴中。PCR反響體系為：總體積25口1,含有50m mol/L KC1, 10m mol/L Tris-HCl （pH 9.0）, 0. l%Triton X-100 , 100 u mol/L dNTPs, 0. 35 u mol/L 引物，2 m mol/L MgCl2,及 0. 5U Taq 酶，1 u 1 模板 DNA。常用的反響體

8、系組成如下擴(kuò)增條件為:94℃變性3分鐘，進(jìn)入循環(huán)，94℃60秒，65℃60秒，72℃60 秒，40個(gè)循環(huán)后72℃延長5分鐘。2.4 2.4 PCR PCR產(chǎn)物的檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠上電泳，澳化乙錠 染色，在紫外光下觀看結(jié)果。為進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性鑒定，可取 PCR產(chǎn)物用Sall酶切，酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外光 下觀看并與標(biāo)準(zhǔn)分子量比擬，可見產(chǎn)生的140bp和77bp兩個(gè)片段。偽狂犬

9、病熒光抗體試驗(yàn)1材料預(yù)備：碳酸鹽緩沖甘油、磷酸鹽緩沖液、丙酮（分析純），偽狂犬病熒光 抗體、冰凍切片機(jī)，熒光顯微鏡。溶液配制見附錄D（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）2操作步驟2. 1樣品采集 撲殺可疑動(dòng)物，取大腦、淋巴結(jié)、扁桃體快速送檢試驗(yàn)室，如 不能準(zhǔn)時(shí)送出，必需凍結(jié)保存，避開腐敗、自溶。本法也可用于對(duì)疑似偽狂犬病 病毒的培育物進(jìn)行鑒定。2. 2切片制備 將樣品組織塊切成1cm X 1cm的面，不經(jīng)任何固定處理，直 接貼于冰凍切片托上，進(jìn)行切片，切片厚

10、度要求5-7um,將切片展貼于0.8mm X 1mm厚的干凈載玻片上。2. 3固定：將切片置純丙酮中固定15分鐘，取出馬上放入0.01mol/L, pH7. 2 的磷酸鹽緩沖液中，輕輕漂洗3—4次，取出，自然干燥后盡快進(jìn)行熒光抗體染色。2. 4染色 將偽狂犬病熒光抗體滴加于切片外表，置溫盒內(nèi)于37℃作用30分 鐘，取出后放入磷酸鹽緩沖液中充分漂洗，再用0.5moL/L, pH9.0—9. 5碳酸鹽 緩沖甘油10義緩沖液 15mM MgC