表達綠色熒光蛋白重組狂犬病病毒Flury-LEP的構(gòu)建及其用于中和抗體檢測的研究.pdf

1、狂犬病街毒是一種嗜神經(jīng)性，能引起幾乎所有哺乳動物發(fā)生腦神經(jīng)炎和100％致死性的病毒。其屬于彈狀病毒科，狂犬病病毒屬，基因組為單股負鏈RNA病毒?；蚪M長約12kb，負責編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白：核蛋白，磷蛋白、基質(zhì)蛋白、糖蛋白和大轉(zhuǎn)錄蛋白。核蛋白、磷蛋白、大轉(zhuǎn)錄蛋白和病毒的基因組構(gòu)成核蛋白體復合物（RNP），僅有它才能啟動病毒復制和蛋白表達。
　　 我國是狂犬病發(fā)病最為嚴重的地區(qū)之一，近些年發(fā)病人數(shù)逐年增加，每年的發(fā)病人數(shù)都在3000～

2、4000之間。數(shù)據(jù)顯示，人狂犬病例中93％都是由犬咬傷發(fā)病的，因此，犬的免疫預防成為對于預防人的狂犬病是非常重要的。
　　 為獲得活的病毒載體疫苗和便利的病毒檢測方法。選用了有很好免疫原性，在我國廣泛用于制備人狂犬病滅火苗、制備動物弱毒苗和滅活苗的Flury-LEP疫苗株，用于建立反向遺傳學系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上，表達綠色熒光蛋白的重組LEP-EGFP病毒被拯救，并進行了分析。本研究為研制以Flury-LEP株病毒活載體多價疫苗、高效

3、安全的基因修飾疫苗奠定了基礎(chǔ)，同時為檢測病毒中和抗體提供了更為方便和經(jīng)濟新方法。
　　 1.為獲得狂犬病病毒載體，在建立Flury-LEP疫苗株反向遺傳學基礎(chǔ)之上，通過已知序列設(shè)計引物，經(jīng)SOE-PCR在Flury-LEP cDNA4096nt處突變出PmeⅠ酶切位點。選用EGFP為報告基因，利用PCR引物設(shè)計技術(shù)在此ORF兩端引入本疫苗株L蛋白轉(zhuǎn)錄開始和終止序列，以及PmeⅠ位點，將此報告基因克隆入病毒cDNA PmeⅠ位點處

4、構(gòu)建了表達綠色熒光蛋白（GFP）的重組LEP基因組cDNA克隆pCI-LEP-EGFP。將PCI-LEP-EGFP和輔助質(zhì)粒PCAGG-N、PCAGG-P、PCAGG-L共轉(zhuǎn)染293T細胞，熒光顯示成功拯救重組病毒LEP-EGFP。
　　 2.為獲得狂犬病病毒LEP-EGFP作為載體的生物學特性。LEP-EGFP和野生型LEP（wtLEP）以M.0.I.為0.01分別感染NA細胞和BHK-21細胞，在24h、72h和120h取樣

5、滴定，生長動力學特性與親本株無明顯差異。wtLEP和LEP-EGFP分別顱內(nèi)接種Balb/c雌性小鼠，Reed-Muench法計算LD50分別為6.3個FFU和8.8個FFU，兩毒株小鼠的致病性沒有顯著差異。LEP-EGFP在BHK-21細胞中連續(xù)傳代9次，各代保持EGFP的穩(wěn)定表達及生物學特性不變。
　　 3.為鑒定EGFP表達是否影響Flury-LEP活疫苗載體免疫原性，和開發(fā)更為方便、快捷中和抗體檢測方法。wtLEP和LE

6、P-EGFP分別以股內(nèi)側(cè)免疫7周齡Balb/c，三周后采血，所獲得的抗體滴度顯示了很好的一致性（P>0.05）。比格犬免疫Flury-LEP弱毒苗或滅活苗三周后獲得血清，經(jīng)IFAT（Indirect fluorescent antibody test）和LEP-EGFP直接熒光下檢測中和50％攻擊毒株抗體滴度，兩種方法檢測的中和抗體滴度顯示很好的相似性（P>0.05）。
　　 本研究獲得了重組LEP-EGFP疫苗載體，其在致病性