家兔波氏桿菌新免疫原性蛋白的原核表達及免疫效果的研究.pdf

1、兔支氣管敗血波氏桿菌病是由波氏桿菌(Bordetella Bronchiseptica，Bb)引起的一種家兔慢性呼吸道傳染病，該病病程較長，傳播廣泛，較難治愈，給養(yǎng)兔業(yè)帶來了嚴重的的經(jīng)濟損失。目前預(yù)防該病的全菌滅活疫苗的保護力較低，急需研究新的疫苗候選成分，為該病的診斷和預(yù)防提供依據(jù)。外膜蛋白(Outer membrane proteins，OMPs)在抗藥性、致病性、免疫原性等方面具有重要作用。本研究基于實驗室前期在兔波氏桿菌外膜蛋白

2、免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究，通過生物信息學(xué)分析，挑選5個新發(fā)現(xiàn)的免疫原性蛋白做為靶蛋白，原核表達后免疫動物，結(jié)果顯示外膜孔蛋白前體和假定的脂蛋白具有免疫保護性，為波氏桿菌疫苗有效成份分析提供依據(jù)，也為波氏桿菌新型亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　1.靶蛋白基因的克隆及序列分析
　　基于實驗室前期在兔波氏桿菌免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果，通過生物信息學(xué)分析篩選了兔波氏桿菌5個具有免疫原性的蛋白（分別為假定的氨基酸ABC轉(zhuǎn)運可溶性結(jié)合蛋白，AB

3、C;賴氨酸/異亮氨酸/纈氨酸結(jié)合蛋白前體，BPP;保守的假定蛋白，CHP;可能的脂蛋白，PL;外膜孔蛋白前體，PPP）作為靶蛋白，參考GeneBank所公布的靶蛋白基因序列用Oligo6.24軟件設(shè)計了5對特異性引物，PCR擴增出靶基因的全長序列，產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后與pMD-18 T載體連接，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細菌后，篩選出陽性克隆。采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，并進行雙酶切和測序鑒定。測序結(jié)果表明，擴增的基因與參考序列的同源性均達97％

4、以上，為靶基因的開放式閱讀框核酸序列。
　　2.靶蛋白原核表達及免疫原性分析
　　本研究將成功構(gòu)建的克隆載體和表達載體pET-28a(+)分別經(jīng)雙酶切處理后，進行連接轉(zhuǎn)化，獲取陽性的重組質(zhì)粒。加入IPTG誘導(dǎo)后，成功表達了5個靶蛋白，條帶大小:ABC蛋白為56.6 KD，BPP蛋白為39.7 KD，CHP蛋白為21.6 KD，PL蛋白為41.5 KD，PPP蛋白為41.3 KD，與預(yù)期大小相符。優(yōu)化表達及純化條件，對純化的蛋

5、白進行WB分析，結(jié)果表明獲得的5個重組蛋白均能與兔支氣管敗血波氏桿菌陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的免疫原性。
　　3.重組蛋白免疫效果評價
　　將表達的重組蛋白與等量的佐劑混合乳化后免疫小鼠，每組9只，免疫兩次，每次間隔2周，首免前和首免、二免后10天各采血一次（隨機選取五只小鼠），分離血清，間接ELISA方法檢測抗體效價。二免后第14天，每組取8只小鼠，用濃度為1.74*107cfu/ml的波氏桿菌腹腔攻毒。結(jié)果表明二

6、免后各試驗組小鼠體內(nèi)IgG抗體水平均達到了較高的水平，攻毒保護試驗結(jié)果顯示PPP蛋白和PL蛋白對小鼠的保護力較好，而ABC蛋白、BPP蛋白、CHP蛋白的保護力與對照組相差不大，PPP蛋白保護力62.5％，PL蛋白保護力50％，顯著高于陰性對照組12.5％。
　　對獲得的免疫保護性較高的PPP蛋白與PL蛋白進一步進行抗體亞型分類檢測，結(jié)果顯示，PPP蛋白免疫組小鼠均產(chǎn)生了較高水平的特異性IgG1和IgG2a抗體，表明PPP蛋白既可刺

7、激機體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，也可產(chǎn)生細胞免疫反應(yīng)，但是特異性IgG1抗體水平高于特異性IgG2a抗體水平，說明PPP蛋白所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)以Th2型為主導(dǎo);PL蛋白和全菌蛋白免疫組小鼠主要產(chǎn)生了IgG1型抗體，而IgG2a型抗體較少，說明PL蛋白和全菌蛋白主要刺激機體的體液免疫反應(yīng)，所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)也是Th2型為主導(dǎo)。分別取PPP蛋白、PL蛋白、全菌蛋白免疫小鼠的脾臟，分離脾淋巴細胞，MTT法測定脾淋巴細胞增殖反應(yīng)，并分別用蛋白刺激脾淋巴細胞

8、，試劑盒檢測淋巴細胞上清液IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。結(jié)果顯示PPP、PL蛋白刺激后，能誘生IFN-γ、IL-2、IL-4顯著升高，全菌蛋白組升高不明顯;PL蛋白誘生IL-10顯著升高，PPP蛋白和全菌蛋白組升高不明顯?？贵w亞型分類檢測證明PPP蛋白與PL蛋白在小鼠體內(nèi)引起了較高的體液免疫，而且PPP蛋白可以在小鼠體內(nèi)引起一定的細胞免疫;淋巴細胞增殖試驗顯示PPP蛋白與PL蛋白能有效刺激淋巴細胞增殖;細胞因子檢測結(jié)果