胸膜肺炎放線桿菌保守表面蛋白的鑒定與免疫原性研究.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)，是一種有莢膜的革蘭氏陰性球桿菌，它作為豬傳染性胸膜肺炎的病原體，引起全球養(yǎng)豬業(yè)的巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)莢膜多糖的不同，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)15種血清型的胸膜肺炎放線桿菌，它們?cè)诙玖偷鼐壏植忌铣尸F(xiàn)多樣性。APP血清型的多樣性給它的預(yù)防和控制工作帶來(lái)了很大的困難。APP血清型的多樣性在致病與免疫機(jī)制的研究以及臨床和流行病學(xué)的應(yīng)用方面都有很重要的意義。目前

2、，通常用來(lái)預(yù)防APP的疫苗為全細(xì)胞滅活苗或亞單位疫苗（如外毒素ApxⅠ，ApxⅡ或ApxⅢ，外膜蛋白）。但這些疫苗只能對(duì)同源或部分異源血清型的APP有較好的免疫保護(hù)作用。雖然減毒活疫苗也有效果，但由于安全問(wèn)題，減毒苗尚未被批準(zhǔn)用于豬場(chǎng)。因此，新型的能夠?qū)苟喾NAPP血清型的保護(hù)性抗原的鑒定及評(píng)估，是非常必要的。本研究通過(guò)對(duì)APP14個(gè)血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株的比較基因組雜交和轉(zhuǎn)錄譜分析，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，鑒定出39個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的保守的外膜蛋白和外

3、膜脂蛋白，并成功表達(dá)純化了其中12個(gè)蛋白。用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其免疫原性進(jìn)行了研究。
　　 1.胸膜肺炎放線桿菌的比較基因組雜交的研究分析
　　 根據(jù)三個(gè)完全測(cè)序APP菌株（血清3型JL03株，血清5型L20株和血清7型AP76株）的全基因組序列，用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了它們的保守表面蛋白。在APPJL03株的2097個(gè)ORFs中，有501個(gè)蛋白存在于細(xì)胞表面，375個(gè)蛋白有信號(hào)肽，其中有52個(gè)蛋白預(yù)測(cè)為外膜蛋白。經(jīng)過(guò)對(duì)APPL0

4、3株、L20株和AP76株的BLASTP分析，發(fā)現(xiàn)這三種血清型菌株之間有1851個(gè)同源基因，其中318個(gè)同源基因可能編碼表面抗原（271個(gè)膜蛋白和47個(gè)脂蛋白）。
　　 根據(jù)APPJL03全基因組序列設(shè)計(jì)連續(xù)的60nt的寡核苷酸探針，采用原位合成的方法制作高密度APP基因組芯片。提取14個(gè)血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株（測(cè)試菌株）的基因組和JL03株（參考菌株）的基因組DNA，分別用Cy5和Cy3進(jìn)行標(biāo)記，分別與高密度APP基因組芯片進(jìn)行雜交。

5、對(duì)芯片雜交數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)測(cè)試菌株與JL03株相比，差異基因的比例在2.9％-4.2％之間，并且有201個(gè)基因在至少一株測(cè)試菌株中缺失或顯著差異。一些已知的與血清型多樣性相關(guān)的基因位點(diǎn)（莢膜多糖合成基因簇、O-抗原合成基因簇、Apx毒素操縱子等）再次被確認(rèn)，并發(fā)現(xiàn)了一些新的候選基因。在JL03株中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)潛在的基因島(GI-1，-2，-3，4，-5)，它們可能與JL03株的血清型特異性相關(guān)。同時(shí)比較不同血清型的標(biāo)準(zhǔn)菌株和JL03株的

6、譜系關(guān)系，將這些菌株分成了4組，即1.1（血清型2，3，4，6），2.1(血清型5b和9)，2.2（血清型1，7，11，12），2.3（血清型5a，8，10，13）。該研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步揭示APP的遺傳多樣性奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.胸膜肺炎放線桿菌轉(zhuǎn)錄譜的比較分析
　　 選取APP上的2866個(gè)非冗余的基因，設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，采用原位合成的方法制作APP的表達(dá)譜芯片。分別提取14個(gè)血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成

7、cDNA，然后再合成cRNA，用Cy3進(jìn)行標(biāo)記，分別與APP的表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)，656個(gè)基因在所有菌株全基因組水平穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄。結(jié)合比較基因組雜交和轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)，APP中三個(gè)占主要優(yōu)勢(shì)的基因座（莢膜多糖合成基因簇、O-抗原合成基因簇、Apx毒素操縱子）在不同的血清型之間有較大差異，這些基因的差異直接導(dǎo)致APP血清型的多樣性。此外，在14個(gè)APP血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株中，有39個(gè)保守的表面蛋白基因均能穩(wěn)定

8、轉(zhuǎn)錄，可以作為潛在的疫苗候選靶標(biāo)，對(duì)APP新型疫苗的開發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。
　　 3.胸膜肺炎放線桿菌保守表面抗原的免疫原性研究
　　 根據(jù)比較基因組雜交和轉(zhuǎn)錄譜分析的結(jié)果，本研究從JL03株基因組中成功克隆了20個(gè)保守的表面蛋白基因到表達(dá)載體pET-28a中，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了其中的12個(gè)，純化獲得12種重組蛋白。用小鼠模型比較研究了它們對(duì)同源血清型（血清3型JL03株）的免疫保護(hù)作用，然后，用其中3個(gè)免疫原性較