豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白病毒樣顆粒的制備及其免疫原性的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)的感染與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的發(fā)生密切相關(guān)。PMWS主要發(fā)生在5～18周齡仔豬,患病豬主要臨床表現(xiàn)為生長緩慢、體重減輕、呼吸困難、黃疸、腹瀉、皮炎、淋巴結(jié)腫大和病毒血癥,致死率在1％～10％之間。PCV2感染呈世界性分布,已成為危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要病因之一。

2、國內(nèi)外相繼注冊了包括滅活疫苗、嵌合疫苗和亞單位疫苗,在預(yù)防PCV2感染中發(fā)揮了重要作用。由于抗原制備成本居高不下,導(dǎo)致市場供應(yīng)的各種疫苗單頭份價格在8～48元人民幣之間,高昂的疫苗價格嚴(yán)重制約了PCV2疫苗的推廣使用。根據(jù)PCV2 ORF2基因編碼的主要免疫原性蛋白Cap具有在體外自我組裝成病毒樣顆粒(Virus—like particles,VLPs)的特點,結(jié)合SUMO蛋白表達(dá)技術(shù),我們首次利用E.coli表達(dá)的重組蛋白在體外制備C

3、ap蛋白VLPs,為研制PCV2 VLPs疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 1.將PCV2 ORF2編碼完整Cap蛋白基因克隆到帶有小泛素樣蛋白(SUMO)和多聚組氨酸(6×His)的原核表達(dá)載體pSK中,轉(zhuǎn)化克隆菌株JM109感受態(tài)細(xì)胞,將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為p—SMK—Cap。將p—SMK—Cap轉(zhuǎn)化到表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21-Condon plus(DE3)中表達(dá)重組蛋白。利用SDS—PAGE電泳可觀察到部分重組蛋白以水溶性形式

4、表達(dá),親和層析純化目的蛋白以單一特異性條帶出現(xiàn),大小約為43 kDa,免疫印記試驗和ELISA試驗均證實重組表達(dá)的Cap蛋白具有良好的反應(yīng)原性,命名為His—SUMO—Cap。
　　 2.利用SUMO蛋白酶切除重組蛋白His—SUMO—Cap上的SUMO標(biāo)簽,親和層析純化后獲得不帶有任何氨基酸殘基的“天然Cap蛋白(nCap)”,大小為23 kDa。利用透射電鏡觀察nCap蛋白能夠自我組裝形成直徑17nm大小的VLPs,形態(tài)結(jié)構(gòu)

5、類似與親本PCV2 Cap蛋白,它能夠和PCV2血清抗體反應(yīng)并形成抗原抗體復(fù)合物,說明E.coli表達(dá)的重組蛋白能夠形成正確病毒衣殼結(jié)構(gòu)。
　　 3.將His-SUMO—Cap、nCap和InvCap疫苗分別免疫小鼠。利用間接ELISA可檢測到Cap蛋白特異性抗體。檢測發(fā)現(xiàn),外周血中的細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN—γ表達(dá)量有所上調(diào),利用流式細(xì)胞儀檢測三種Cap抗原免疫小鼠后21天和28天時外周血T淋巴細(xì)胞亞群

6、的變化的結(jié)果表明,空白組CD3+T淋巴細(xì)胞總數(shù)與抗原免疫組之間統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.05),而不同抗原之間的CD3+T淋巴細(xì)胞總數(shù)、CD3+／CD4+和CD3+／CD8+淋巴細(xì)胞總數(shù)和百分率差異不顯著。
　　 4.利用納米粒度儀檢測制備的PCV2 nCap VLPs大小,然后以其作為抗原接種豬,以InvCap疫苗作為免疫對照。PCV2 nCap VLPs抗原免疫豬后產(chǎn)生的抗體消長規(guī)律同InvCap疫苗基本一致,免疫后的豬在7天