攜帶卵清蛋白T細(xì)胞表位的兔出血癥病毒VP60蛋白病毒樣顆粒的表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、兔出血癥（RabbitHemorrhagicDisease，RHD）是由兔出血癥病毒(RabbitHemorrhagicDiseaseVirus，RHDV)引起的兔的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病，以致死性和全身實(shí)質(zhì)器官出血為主要特征。RHDV是杯狀病毒科成員，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在兔體內(nèi)可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答和粘膜免疫應(yīng)答，還有極強(qiáng)的誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的能力。RHDV僅有一個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60，VP60在動(dòng)物體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生

2、中和抗體，與免疫反應(yīng)直接相關(guān)，是病毒免疫保護(hù)性抗原。VP60衣殼蛋白在體外可自然聚合成不包裹核酸的、與天然RHDV病毒粒子在物理形態(tài)上類似的病毒樣顆粒(virus-likeparticles，VLPs)。這種病毒樣顆粒具有良好的免疫原性，本身可作免疫佐劑，通過胞吞或胞飲途徑進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞，分別誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。有研究證實(shí)這種病毒樣顆粒也可嵌合表達(dá)外源基因，或作為疫苗載體。
　　為了探究兔出血癥病毒樣顆粒(RHDV-

3、VLPs)容納外源表位的能力，了解其適宜的外源片段插入位點(diǎn)，探索嵌合VLPs的組裝及其免疫原性，初步評(píng)價(jià)RHDVVLPs作為外源表位展示系統(tǒng)的可行性，本研究在RHDV衣殼蛋白VP60的C末端插入OVAT細(xì)胞抗原表位，將VF60的502-510位、411-417位、302-309位氨基酸分別替換為OVAT細(xì)胞抗原表位（雞源卵清蛋白OVA257-264位氨基酸，序列SIINFEKL），通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建4種重組兔出血癥病毒樣顆粒（RH

4、DV-VLPs），通過電鏡觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究外源片段對(duì)VLPs的組裝及免疫原性的影響。
　　主要試驗(yàn)和結(jié)果如下:
　　1.重組穿梭載體的構(gòu)建通過PCR，在RHDVVP60基因序列的特定區(qū)域直接插入OVACD8+T細(xì)胞表位(SIINFEKL)，或通過SOE法對(duì)RHDVVP60基因序列的特定區(qū)域進(jìn)行部分缺失并用OVACD8+T細(xì)胞表位(SIINFEKL)替換，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入載體pMD19-T，經(jīng)酶切鑒定后，將目的片段連

5、接至真核表達(dá)載體pFastBac1，并對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及PCR鑒定后獲得重組質(zhì)粒，分別命名為Bacmid-V-579、Bacmid-V-502-510、Bacmid-V-411-417、Bacmid-V-302-309。
　　2.蛋白表達(dá)及鑒定將獲得的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。逐日觀察，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)，收獲病毒rBac-v-579、rBac-v-502-510、rB

6、ac-v-411-417、rBac-v-302-309。提取細(xì)胞內(nèi)總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，陽性樣品作為重組桿狀病毒原液進(jìn)行擴(kuò)增和傳代，并通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、血凝試驗(yàn)(HA)、蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(Western-blot)等鑒定嵌合蛋白vp60-ova/579、vp60-ova/502-510、vp60-ova/411-417、vp60-ova/302-309的表達(dá)。RT-PCR結(jié)果證實(shí)4組目的基因

7、mRNA在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)錄;IFA結(jié)果顯示4種重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá);SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，4種嵌合蛋白均在Sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，大小約為60kDa;Western-blot結(jié)果顯示，4種嵌合蛋白均能被RHDV單抗A3C特異性識(shí)別，證明4種嵌合蛋白的載體具有良好的反應(yīng)原性;此外，血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4種嵌合蛋白中，vp60-ova/579和vp60-ova/302-309有血凝性，vp60-ova/502-510和vp60-

8、ova/411-417血凝性消失。
　　3.嵌合蛋白的電鏡觀察和免疫原性分析
　　對(duì)4種嵌合蛋白進(jìn)行濃縮純化及定量分析，通過電鏡觀察嵌合蛋白形成病毒樣粒子的能力。將4種純化定量的嵌合蛋白(vp60-ova/579、vp60-ova/502-510、vp60-ova/411-417和vp60-ova/302-309)，免疫接種7-8周齡C57BL/6雌性小鼠，設(shè)VP60、OVA多肽、無菌PBS為對(duì)照，各免疫三次，間隔兩周，每只

9、小鼠每次免疫40μg蛋白，分別在未免、二免后2周及三免后2周采集小鼠血清，間接ELISA測(cè)定0d、28d、42d血清中VP60抗體水平，試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清中TNF-α含量。結(jié)果顯示:4種嵌合蛋白中，vp60-ova/579、vp60-ova/502-510、vp60-ova/411-417及vp60-ova/302-309均可形成VLPs，大小約為40nm，形態(tài)與天然兔出血癥病毒樣粒子類似。4種嵌合蛋白均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生不同程度的針對(duì)

10、VP60載體的體液免疫應(yīng)答和針對(duì)OVAT細(xì)胞表位的細(xì)胞免疫應(yīng)答。其中，vp60-ova/579能引起較低的針對(duì)VP60的體液免疫應(yīng)答和較高的針對(duì)OVAT細(xì)胞表位的細(xì)胞免疫應(yīng)答。初步推測(cè)，VP60579位氨基酸可能是4個(gè)位點(diǎn)中攜帶外源T細(xì)胞表位的較優(yōu)位點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了攜帶CD8+T細(xì)胞表位的VP60嵌合蛋白。該T細(xì)胞表位來自雞源卵清蛋白OVA257-264(SIINFEKL)，受MHCⅠ類分子限制。T細(xì)胞表位分別嵌合在RHDV