運(yùn)載OVA CD8+T細(xì)胞表位的兔出血癥病毒樣顆粒的表達(dá)及免疫原性研究.pdf

1、兔出血癥(RabbitHemorrhagicDisease，RHD)是由兔出血癥病毒(RabbitHemorrhagicDiseaseVirus，RHDV)引起的兔的一種急性、敗血性、高度接觸傳染性、致死性和以全身實(shí)質(zhì)器官出血為主要特征的傳染病。RHDV是杯狀病毒科成員，結(jié)構(gòu)簡單，僅有一個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60，研究發(fā)現(xiàn)RHDV在兔體內(nèi)可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答和粘膜免疫應(yīng)答，而且RHDV還有極強(qiáng)的誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的能

2、力。為了探究兔出血癥病毒樣顆粒（RHDV-VLPs）容納外源抗原決定簇的能力，本文主要通過對(duì)RHDVVP60N端不同位點(diǎn)進(jìn)行缺失和取代，研究VP60基因N端序列對(duì)RHDVVLPs影響，并以運(yùn)載的OVA257-264CD8+T細(xì)胞(SIINFEKL)表位為參照，通過電鏡觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究VLPs組裝所展示外源表位的長度、構(gòu)象和抗原性，初步評(píng)價(jià)RHDVVLPs其作為外源表位展示系統(tǒng)的可行性并且為RHDV衣殼蛋白的形成機(jī)制和其它方面提供參考

3、依據(jù)。
　　 主要的試驗(yàn)和結(jié)果如下:
　　 1.重組穿梭載體的構(gòu)建通過SOE法對(duì)RHDVVP60基因序列的N端進(jìn)行部分缺失或用CD8+T細(xì)胞表位(SIINFEKL)替換RHDV衣殼蛋白VP60的特定區(qū)域，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入載體pMD19-Tvector，經(jīng)酶切鑒定后、將目的片段連接至真核表達(dá)載體pFastBaeTM1，并對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序，獲得的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及PCR鑒定后獲得重組質(zhì)粒

4、，分別命名為N1、N2、I1、I2和D1。
　　 2.蛋白表達(dá)及鑒定將獲得的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。逐日觀察細(xì)胞，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)，收獲病毒。提取細(xì)胞內(nèi)總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，陽性樣品作為重組桿狀病毒原液進(jìn)行擴(kuò)增和傳代，并通過間接免疫熒光(IFA)、血凝試驗(yàn)(HA)、蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(Western-blot)等試驗(yàn)鑒定蛋白的表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示5種重組桿狀病毒在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)錄

5、;IFA結(jié)果顯示5種重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá);SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，5種嵌合蛋白均在Sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且大小約為60kDa;Western-blot結(jié)果顯示，5種嵌合蛋白(N1、N2、I1、I2和D1)均能被RHDV單抗A3C特異性識(shí)別，證明5種嵌合蛋白的載體具有良好的反應(yīng)原性;本試驗(yàn)中表達(dá)的5種嵌合蛋白，僅N1和N2有血凝性。
　　 3.嵌合蛋白的電鏡觀察和免疫原性對(duì)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的5種嵌合蛋白進(jìn)行電鏡

6、觀察，初步純化4種嵌合蛋白(N1、N2、I1、I2)免疫接種7～8周齡C57BL/6雌性小鼠，設(shè)RHDV-VLPs-VP60、無菌PBS為對(duì)照，共免疫三次，每次間隔兩周，分別在二免及三免后兩周摘眼球取血，脫頸處死小鼠，無菌取脾。間接ELISA測(cè)定0d、28d、42d血清中VP60抗體水平;分離淋巴細(xì)胞，ELISPOT檢測(cè)特異性分泌IFN-γ水平。結(jié)果顯示:5種嵌合蛋白中，N1、N2可形成完整的VLPs，大小約為40nm，形態(tài)與天然兔出血

7、癥病毒樣粒子類似;I1、I2形成的病毒樣粒子較小約30nm;D1形成VLPs數(shù)量很少，幾乎不可見。4種嵌合蛋白(N1、N2、I1、I2)通過腹腔注射途徑免疫均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗載體VP60的體液免疫應(yīng)答和針對(duì)外源T細(xì)胞表位的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中I1、I2所引發(fā)的針對(duì)載體特異性抗體水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平均較高，而N1、N2較低。可初步推測(cè)，VP60第196～229位aa區(qū)域可能是N端攜帶外源T細(xì)胞表位的較優(yōu)區(qū)域。
　　 本文構(gòu)建整合C

8、D8+T細(xì)胞表位的嵌合蛋白。該T細(xì)胞表位來自雞源卵清蛋白OVA257-264(SIINFEKL)，受MHCⅠ類分子限制。T細(xì)胞表位分別嵌合在RHDVVLP的不同位置:1）直接插入VP60的N末端(N1);2)取代VP60N端2～13位氨基酸殘基(N2);3)缺失、取代VP60N端196～207位氨基酸殘基（D1和I1）;4）取代VP60N端217～228位氨基酸殘基(I2)。嵌合RHDV病毒樣粒子作為疫苗載體的研究結(jié)果表明，RHDV-V