

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、兔病毒性出血癥(RHD)是由兔病毒性出血癥病毒(RHDV)引起的兔的傳染性疾病,病程短,死亡率高,可造成養(yǎng)兔業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。VP60蛋白是RHDV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白,在動(dòng)物體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,與免疫反應(yīng)直接相關(guān)。目前廣泛使用的RHDV疫苗為組織滅活苗,雖然長(zhǎng)期以來(lái)一直具有良好的免疫效果,但其自身具有不可避免的種種缺陷。由于兔病毒性出血癥病毒在體外組織細(xì)胞的培養(yǎng)方法尚未建立,所以近年來(lái),人們對(duì)RHDV疫苗的研制主要著眼于基因工程苗的研制
2、,其既能起到免疫預(yù)防作用,又能很好的解決組織滅活苗的種種缺陷。因此,本研究利用RT-PCR技術(shù)把VP60基因克隆入腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中,構(gòu)建成重組腺病毒,使VP60基因獲得表達(dá),并研究其抗原性和免疫原性,以期為研究RHDV重組腺病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。 本研究據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株的基因序列(M67473),設(shè)計(jì)合成了一對(duì)針對(duì)VP60基因的特異性引物,在上游引物的5’端加入Kpn I酶切位點(diǎn)和起始密碼子,下游引物的5’端加
3、入Xho I酶切位點(diǎn)和終止密碼子。用RT-PCR技術(shù)從上海RHD兔的肝臟內(nèi)擴(kuò)增出大小為1740bp的PCR產(chǎn)物,經(jīng)純化后與PMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α,然后在氨芐抗性(Amp+)平板上挑取陽(yáng)性菌落,過(guò)夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒,經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切鑒定后進(jìn)行DNA序列測(cè)定。用DNAStar軟件分析結(jié)果表明:擴(kuò)增片斷與預(yù)期片斷大小相符,完全符合載體閱讀框。該株VP60基因序列(命名為SH-VP60)與國(guó)內(nèi)外其它分離株同源性為90.
4、2%~98.2%。將目的基因亞克隆至穿梭載體pShuttle-CMV,得到重組質(zhì)粒pShuttle-VP60,轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coli DH5α中,提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒,與骨架載體pAdEasy-1按一定比例混合,通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入E.coli BJ5183中,使它們?cè)贓.coli BJ5183中發(fā)生同源重組,從而使所克隆入穿梭載體內(nèi)的VP60基因進(jìn)入腺病毒骨架載體。轉(zhuǎn)化后的E.coli BJ5183經(jīng)卡那霉素篩選得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pAd-VP6
5、0。Pac I酶單酶切線性化后,在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后觀察細(xì)胞病變,當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí),收獲病毒。經(jīng)IFA、SDS-PAGE和Western-blotting等鑒定,重組腺病毒VP60蛋白(約60KDa)在HEK293細(xì)胞中得到表達(dá)。 利用重組腺病毒表達(dá)的RHDV衣殼蛋白接種免疫2月齡以上非RHD免疫兔,結(jié)果顯示該表達(dá)的重組衣殼蛋白在免疫后22天可以誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生抗RHDV抗體,其誘導(dǎo)的血凝抑制抗
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 兔出血癥病毒亞基因組在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性研究.pdf
- 表達(dá)水泡性口炎病毒G蛋白重組腺病毒的構(gòu)建與免疫原性分析.pdf
- 豬圓環(huán)病毒2型重組腺病毒載體疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf
- 亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重組腺病毒的構(gòu)建、表達(dá)及免疫原性研究.pdf
- 兔瘟病毒VP60基因重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫原性.pdf
- 表達(dá)兔出血癥病毒vp60基因的重組犬2型腺病毒的構(gòu)建及其免疫效力評(píng)價(jià).pdf
- 新型鴨呼腸孤病毒σC基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性的初步研究.pdf
- 重組丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位的表達(dá)及免疫原性.pdf
- 攜帶卵清蛋白T細(xì)胞表位的兔出血癥病毒VP60蛋白病毒樣顆粒的表達(dá)及其免疫原性研究.pdf
- 口蹄疫病毒P1基因和乙型腦炎病毒E基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)及其免疫原性研究.pdf
- Ad35腺病毒載體構(gòu)建及病毒蛋白免疫原性研究.pdf
- 鴨腺病毒蜂膠滅活疫苗的研制及其免疫原性研究.pdf
- 甲戊肝炎病毒重組抗原的表達(dá)、純化和免疫原性鑒定.pdf
- 禽呼腸孤病毒σC基因的克隆表達(dá)及其免疫原性初步研究.pdf
- PCV2 ORF2基因與佐劑基因Ag85A共表達(dá)重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf
- 表達(dá)水貂腸炎病毒VP2蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建及其免疫原性分析.pdf
- 重組輪狀病毒VP4抗原的表達(dá)及免疫原性研究.pdf
- 運(yùn)載OVA CD8+T細(xì)胞表位的兔出血癥病毒樣顆粒的表達(dá)及免疫原性研究.pdf
- 表達(dá)IL-21重組狂犬病病毒免疫原性研究.pdf
- 登革病毒prM-E基因的多價(jià)重組質(zhì)粒DNA的免疫原性研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論