新型鴨呼腸孤病毒σC基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性的初步研究.pdf

1、近年來(lái)，我國(guó)水禽的呼腸孤病毒感染不斷發(fā)生，并逐漸呈流行趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了水禽業(yè)的健康發(fā)展。1997年我國(guó)番鴨出現(xiàn)以軟腳、腹瀉、肝白色壞死為主要特征的番鴨肝白點(diǎn)病，2005年出現(xiàn)以心、脾、肝、法氏囊等多器官出血/壞死為主要特征的鴨壞死性肝炎，證明其其病原均為禽呼腸孤病毒（Avianreo virus，ARV）。研究表明，禽呼腸孤病毒感染無(wú)論從流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化，以及病毒生物學(xué)特性、基因組片段特征和序列同源性等方面均發(fā)生了變化。本實(shí)

2、驗(yàn)室從太湖發(fā)病鴨廠的病鴨組織中分離了一株病毒，經(jīng)證明其為新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV），將該病毒命名為新型鴨呼腸孤病毒太湖2011株（NDRV TH11）。
　　σC蛋白為禽呼腸孤病毒的吸附蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，σC蛋白還能夠與呼腸孤病毒競(jìng)爭(zhēng)性的吸附細(xì)胞，吸附后可阻斷病毒對(duì)細(xì)胞的吸附，所以以σC蛋白制備的基因工程苗具有良好的免疫保護(hù)性。本研究制備了NDRVσC蛋白的兔源多克隆抗體

3、，構(gòu)建重組桿狀病毒BV-σC，并對(duì)表達(dá)的σC蛋白進(jìn)行疫原性檢測(cè)和動(dòng)物試驗(yàn)。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1. NDRVσC蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-σC，將原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-σC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)后獲得的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE，Western blot鑒定，結(jié)果獲得大小約為34KD的重組蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符，且表達(dá)的重組蛋白具生物學(xué)活性，以純化的σ

4、C蛋白免疫實(shí)驗(yàn)兔制備了抗σC蛋白的多克隆抗體，間接 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示其效價(jià)達(dá)1∶20000以上；間接免疫熒光試驗(yàn)表明，多克隆抗體能夠特異性識(shí)別NDRV的σC蛋白,顯示出σC蛋白具有良好的免疫原性。
　　2.NDRVσC蛋白在sf9細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定
　　將NDRVσC基因插入桿狀病毒載體pFastBacTM1，經(jīng)過(guò)同源重組，藍(lán)白斑篩選，獲得重組穿梭桿粒Bacmid-σC，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染空Bacmid作對(duì)照，獲

5、得的重組桿毒通過(guò)噬斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定的病毒滴度為2x107pfu/ml。通過(guò)SDS-PAGE，證明成功表達(dá)了σC蛋白，Western-blot、IFA結(jié)果表明表達(dá)的σC蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
　　3.重組NDRVσC蛋白的免疫原性的初步研究
　　重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，σC蛋白可在細(xì)胞中大量表達(dá)，將表達(dá)的σC蛋白制備成疫苗,免疫1周齡的雛鴨，首免兩周后加強(qiáng)免疫一次，結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)組一免2周后中和抗體產(chǎn)生,加強(qiáng)免疫后的抗體水