口蹄疫病毒P1基因和乙型腦炎病毒E基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、口蹄疫病毒（FMDV）是嚴(yán)重危害豬、牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的傳染病，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防和控制這種傳染病的主要措施是對潛在易感宿主進(jìn)行大范圍全面地免疫接種。而目前用于預(yù)防口蹄疫的常規(guī)疫苗都存在潛在的散毒危險(xiǎn)，因此研制新型疫苗迫在眉睫。
　　 乙型腦炎是一種由同本乙型腦炎病毒（JEV）侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的潛在致命性傳染病。此病可通過蚊子傳染給人類，而豬是公認(rèn)的主要擴(kuò)增宿主和傳染源。目前廣泛使用的無論是人乙型腦炎鼠腦純化滅活疫苗

2、，還是豬乙型腦炎滅活疫苗或減毒活疫苗因?yàn)槠渖a(chǎn)費(fèi)用昂貴、缺少長期免疫力，潛在的散度風(fēng)險(xiǎn)以及可能引起的過敏反應(yīng)等，而限制了這些疫苗被廣泛應(yīng)用。
　　 植物可飼疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比具有無動(dòng)物病原體污染、生產(chǎn)廉價(jià)、儲存和運(yùn)輸熱穩(wěn)定等優(yōu)勢，近年成為研究的熱點(diǎn)。水稻作為一種生物反應(yīng)器，被廣泛地用于表達(dá)人和動(dòng)物病原體的抗原基因。在水稻中表達(dá)FMDV或JEV的免疫原蛋白來生產(chǎn)新型疫苗不失為一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的策略。針對以上兩種病毒，本研究通過農(nóng)桿菌侵

3、染法獲得了轉(zhuǎn)口蹄疫O/ES/2001株P(guān)1基因和乙型腦炎SA14-14-2株E基因的轉(zhuǎn)基因水稻，并在小鼠模型上對植物來源的P1蛋白和E蛋白的生物學(xué)特性和免疫原性經(jīng)行了研究。具體研究內(nèi)容包括：
　　 1．P1基因和E基因在水稻中的表達(dá)分析
　　 將本實(shí)驗(yàn)室保存的口蹄疫O/ES/2001株P(guān)1基因和乙型腦炎SA14-14-2株E基因首先分別克隆到真核表達(dá)載體pRTL2中，再將構(gòu)建成的含有雙CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子的

4、表達(dá)盒克隆到載體pCAMBIA1301中，分別命名為pCAMRT-P1和pCAMRT-E。用農(nóng)桿菌法分別轉(zhuǎn)化水稻品種同本晴（Nipponbare），經(jīng)Southern blot，Northern blot和Western blot方法檢測，P1基因和E基因均在在水稻中成功表達(dá)。經(jīng)ELISA方法檢測，P1蛋白表達(dá)量達(dá)到0.6至1.3μ g/mg植物總可溶性蛋白，E蛋白表達(dá)量達(dá)到1.1至1.9μ g/mg植物總可溶性蛋白。
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5、．水稻來源的P1蛋白免疫原性研究
　　 將新鮮轉(zhuǎn)基因水稻葉片進(jìn)行研磨，取研磨液與不完全弗氏佐劑混合腹腔注射免疫小鼠。首免后第56天，植物來源P1蛋白誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的口蹄疫病毒特異性血清IgG抗體；中和抗體水平達(dá)到1：20.27，與大腸桿菌來源的P1蛋白誘導(dǎo)的中和抗體相當(dāng)（1：22.4）。用106TCID50口蹄疫病毒0/ES/2001株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒48小時(shí)后檢測小鼠血液中病毒清除情況顯示，100％的小鼠血液沒有引

6、起細(xì)胞病變。
　　 用水稻研磨液口服免疫的小鼠36天后，解剖小鼠并收集近胃部小腸，清洗后進(jìn)行體外培養(yǎng)3天?？诜庖叩男∈篌w內(nèi)也產(chǎn)生了口蹄疫病毒特異性血清IgG抗體，并且水稻來源的P1蛋白誘導(dǎo)的抗體水平顯著高于大腸桿菌來源的P1蛋白誘導(dǎo)的。小腸洗液和體外培養(yǎng)液中檢測到粘膜IgA抗體，證明植物來源的P1蛋白經(jīng)口服誘導(dǎo)了粘膜免疫。用106TCID50口蹄疫病毒0/ES/2001株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒48小時(shí)后檢測小鼠血液中病毒清除情況顯

7、示，只有20％-40％的小鼠血液沒有引起細(xì)胞病變。
　　 3．水稻來源的E蛋白免疫原性研究
　　 保護(hù)動(dòng)物不受JEV的感染主要依靠體內(nèi)抗體水平，尤其是中和抗體水平。用2中的方法免疫小鼠，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，植物來源E蛋白誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的乙型腦炎病毒特異性血清IgG抗體；中和抗體水平達(dá)到1：19.2，顯著高于用大腸桿菌表達(dá)的E蛋白誘導(dǎo)的抗體水平（1：11.2）。
　　 口服免疫30天后，小鼠體內(nèi)也產(chǎn)生了乙型腦炎

8、病毒特異性血清IgG抗體；小腸洗液和體外培養(yǎng)液中檢測到粘膜IgA抗體，且抗體水平顯著高于口服大腸桿菌來源的E蛋白的小鼠，證明植物來源的E蛋白經(jīng)口服誘導(dǎo)了粘膜免疫。
　　 以上結(jié)果明水稻作為一種生物反應(yīng)器可以成功表達(dá)口蹄疫病毒P1蛋白和乙型腦炎病毒E蛋白，為進(jìn)一步研究針對這兩種病毒的可飼疫苗奠定了基礎(chǔ)。下一步研究工作可以從以下兩個(gè)方面進(jìn)行：用分子生物學(xué)的方法提高外源蛋白在水稻中的表達(dá)量，比如使用種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子；從佐劑的使用