口蹄疫病毒P12A-3C基因在百脈根中的表達及其免疫豚鼠試驗.pdf

1、口蹄疫(footandmouthdisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV)引起的一種急性熱性高度接觸性傳染病，對豬牛羊等家畜和許多野生動物危害嚴重。滅活疫苗對口蹄疫的防控起了巨大作用，但其弊端也不容忽視。近些年來，新型口蹄疫疫苗一直是人們研究的方向之一。轉(zhuǎn)基因植物疫苗由于其成本低廉，安全有效，使用方便等優(yōu)點成為科學家研究的熱點。 本研究利用農(nóng)桿菌侵染法將FMDVAsia1

2、/YNBS/58株P(guān)12A-3C基因?qū)肽敛莅倜}根。通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物表達載體，農(nóng)桿菌侵染百脈根外植體及組織培養(yǎng)，抗性植株的檢測篩選，轉(zhuǎn)基因百脈根植株莖葉浸出物免疫豚鼠的研究，探索目的基因在牧草百脈根的轉(zhuǎn)化、表達及免疫活性。主要進行如下工作： 1.目的基因的獲得：Asia1/YNBS/58乳鼠毒，連傳2代乳鼠復(fù)壯，提取病毒總RNA，通過RT-PCR獲得目的基因P12A和3C，將目的基因連接克隆載體，測序分析。結(jié)果表明，P12A全

3、長2247nt，編碼749個氨基酸，結(jié)構(gòu)蛋白P1編碼733個氨基酸，2A編碼16個氨基酸，其中VP4編碼85個氨基酸，VP2編碼218個氨基酸，VP3編碼219個氨基酸，VP1編碼211個氨基酸，通過分析表明FMDV各個結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白切割位點比較保守，各結(jié)構(gòu)蛋白之間聯(lián)接氨基酸分別為A/D，E/G，Q/T，2A的C末端具有保守的DxExNPG多肽序列。細胞受體結(jié)合位點為VP1上的RGD序列。3C全長639nt，編碼213個氨基酸。

4、 2.植物雙元表達載體的構(gòu)建：通過設(shè)計的引物擴增帶有特定酶切位點的目的基因，通過酶切、連接將口蹄疫病毒P12A基因、3C基因串聯(lián)，構(gòu)建植物中間表達載體pBin438-P12A-3C。試驗先將基因片段P12A-3C連接到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，構(gòu)成pcDNA3.1(+)-P12A-3C，然后再將P12A-3C片段從該質(zhì)粒上切下來，連接到pBin438載體上。通過對構(gòu)建好的pBin438-P12A-3C(Mini-Ti)重組質(zhì)粒進

5、行PCR鑒定和序列測定，證明中間表達載體構(gòu)建成功。通過三親雜交法將重組質(zhì)粒pBin438-P12A-3C導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，通過抗性篩選、農(nóng)桿菌提取質(zhì)粒PCR鑒定和序列測定，證明構(gòu)建成功，與農(nóng)桿菌中的help-Ti質(zhì)粒共同組成植物雙元表達載體系統(tǒng)，為下一步的轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。 3.目的基因轉(zhuǎn)化百脈根與蛋白表達檢測：以百脈根子葉、子葉柄為轉(zhuǎn)化受體，通過根癌農(nóng)桿菌GV3101侵染外植體子葉或子葉柄，經(jīng)過愈傷、出芽和生根等過程在含有5

6、0mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基篩選后，獲得抗性植株。對抗性植株進行PCR、RT-PCR和ELISA檢測篩選陽性植株，為下一步動物免疫試驗提供候選植物材料。 4.轉(zhuǎn)基因百脈根免疫豚鼠：將上述檢測陽性的植株蛋白提取液，非轉(zhuǎn)基因植株蛋白提取液，同時設(shè)轉(zhuǎn)基因空載體對照，Asia1滅活苗陽性對照和弗氏佐劑對照分別免疫豚鼠。首次免疫后第14d、28d采血，二免后分別于第7d、14d和21d采血，ELISA檢測表明產(chǎn)生特異性抗體。血清效價最高1∶