2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,F(xiàn)MDV)是單股正鏈RNA病毒,屬于微RNA病毒科口蹄疫病毒屬成員,F(xiàn)MDV對偶蹄動(dòng)物高度致病,包括牛、水牛、豬、山羊、綿羊及多種野生物種。病毒識(shí)別受體是病毒感染的第一步,決定著病毒感染細(xì)胞的類型和宿主嗜性。FMDV可以識(shí)別不同受體,然后介導(dǎo)不同的路徑進(jìn)入細(xì)胞。FMDV通過識(shí)別位點(diǎn)RGD結(jié)合整聯(lián)蛋白受體(αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8)后,通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)

2、吞路徑進(jìn)入細(xì)胞;FMDV還可以同VP3第56位精氨酸(VP3056R)結(jié)合硫酸乙酰肝素受體,通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞路徑進(jìn)入細(xì)胞。整聯(lián)蛋白受體除了介導(dǎo)病毒感染作用外,還具有介導(dǎo)或激發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種作用,這些功能參與病毒的致病機(jī)制還不清楚。因此,本研究為了揭示單個(gè)受體對病毒感染和信號介導(dǎo)的作用,構(gòu)建單個(gè)受體細(xì)胞系,為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。本研究克隆了整聯(lián)蛋白受體αvβ3基因,并構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)αvβ3的CHO-677-αvβ3細(xì)胞系,并評價(jià)

3、了對口蹄疫病毒的易感性,具體內(nèi)容如下:
  (1)αv和β3亞基的克隆:從乳鼠肺組織中分別提取了整聯(lián)蛋白受體αv和β3亞基基因組總RNA,根據(jù)GenBank中已公布的整聯(lián)蛋白αv和β3亞基基因序列,分別設(shè)計(jì)合成兩對特異性引物,RT-PCR擴(kuò)增出鼠源整聯(lián)蛋白αv和β3亞基基因,產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后分別與pGEM-T載體相連,構(gòu)建重組質(zhì)粒,并進(jìn)行多序列比對分析。結(jié)果表明,鼠源整聯(lián)蛋白αv亞基基因全長3135bp,編碼1045個(gè)氨基酸,β

4、3亞基基因全長2364bp,編碼788個(gè)氨基酸。序列同源性比較發(fā)現(xiàn),鼠源αv亞基基因與人、豬同源性較高,而β3亞基基因與牛和綿羊的同源性較高。
  (2)αv和β3蛋白表達(dá)及其多抗的制備:將擴(kuò)增的αv和β3部分胞外域基因分別與原核表達(dá)載體pET-30a相連,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒,測序確認(rèn)讀碼框正確后,將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白。通過SDS-PAGE鑒定后提取包涵體,以電泳分離純化的重組融合蛋白

5、免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,以Western blot鑒定血清特異性。結(jié)果顯示,實(shí)現(xiàn)了重組融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá),SDS-PAGE顯示分子量分別為40 kDa和40 kDa,主要以包涵體形式存在于菌體中,該血清可與目的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
  (3)穩(wěn)定表達(dá)αvβ3細(xì)胞系建立:用高效慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù),構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)αvβ3異二聚體的CHO-677細(xì)胞系,用PCR和IFA分別從基因和蛋白水平檢測了第二十代細(xì)胞系中

6、αv和β3亞基的表達(dá),表明該基因已經(jīng)成功的導(dǎo)入CHO-677細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)。
  (4)對口蹄疫病毒易感性的評價(jià):為了評價(jià)該細(xì)胞系對口蹄疫病毒易感性,用蝕斑實(shí)驗(yàn)、TCID50、實(shí)時(shí)熒光定量和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)比較分析口蹄疫病毒在細(xì)胞系和親本細(xì)胞上的生物學(xué)特性差異,結(jié)果表明感染FMDV/O/ZK/93之后,與親本細(xì)胞相比,CHO-677-αvβ3細(xì)胞系上病毒RNA水平和蛋白表達(dá)量顯著提高。數(shù)據(jù)表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)αvβ3的細(xì)胞系,并

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