表達(dá)豬偽狂犬病毒gC基因和腦心肌炎病毒P1和P12A與3C基因重組腺病毒的構(gòu)建及免疫原性分析.pdf

1、豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒(PRV)引起豬的以發(fā)熱、奇癢和急性腦脊髓炎等為典型癥狀的急性熱性傳染病。豬腦心肌炎是由腦心肌炎病毒(EMCV)引起豬的以腦炎、心肌炎為主要臨床特征的急性傳染病。本研究在PRV閩A株(Fa株)gB、gC、gD基因克隆和序列測(cè)定的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了表達(dá)gB、gC、gD基因的重組質(zhì)粒和表達(dá)gC基因的重組腺病毒，分析了重組質(zhì)粒與全病毒滅活疫苗聯(lián)合免疫和重組腺病毒的免疫效果，探討了重組腺病毒免疫制備gC蛋白單克隆抗體的可行性

2、；構(gòu)建了分別表達(dá)EMCVP1和P12A與3C蛋白酶基因串聯(lián)的重組腺病毒，并在小鼠分析了免疫保護(hù)效果。 對(duì)PRV Fa株gB、gC、gD基因的克隆和序列測(cè)定結(jié)果表明，gB、gc、go基因序列全長(zhǎng)分別為2745 bp、1464 bp、1215 bp，分別編碼914 aa、487 aa、404 aa的多肽；與其它毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的同源性為94.9％-99.9％，氨基酸序列的同源性為91.4％-99.9％，提示gB、g

3、C、go基因在不同PRV毒株間高度保守?；趃B、gC、go基因的進(jìn)化分析表明，中國(guó)分離毒株與韓國(guó)分離毒株可歸為一個(gè)進(jìn)化分支，F(xiàn)a株與Ea株的親緣關(guān)系很近，3個(gè)基因的同源率均在99.5％以上；而日本分離毒株與歐美分離株歸為另一分支。與歐美分離毒株相比，我國(guó)分離株(Ea株、Fa株)gB蛋白氨基酸全長(zhǎng)多1個(gè)氨基酸，氨基酸殘基的突變主要集中在第50-100 aa區(qū)域內(nèi)；gC基因序列的第186-211 bp之間有21個(gè)堿基插入；gD蛋白多2個(gè)以

4、上氨基酸，在gO基因序列的第803-837 bp之間，F(xiàn)a株核苷酸AGGCCC串聯(lián)重復(fù)達(dá)到7個(gè)。 采用Prime-boost免疫策略，將表達(dá)PRV gB、gC、gD基因重組質(zhì)粒DNA(Mix DNA)、gC基因重組質(zhì)粒DNA(gC DNA)與油乳劑滅活苗(KV)聯(lián)合免疫BALB/c小鼠。對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果表明，Mix DNA免疫2次與Kv加強(qiáng)免疫1次的組合抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖(MTT)和足墊遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DT

5、H)應(yīng)答水平最高，中和抗體水平比單獨(dú)。Mix DNA免疫3次組明顯升高，接近KV免疫2次組；gC DNA免疫2次與KV加強(qiáng)1次組的中和抗體水平比gC DNA免疫3次組明顯升高，細(xì)胞免疫水平比KV免疫2次組明顯增強(qiáng)，但均低于Mix DNA免疫和KV加強(qiáng)組。用20 LD<,50> PRV攻毒結(jié)果表明，Mix DNA或gC DNA免疫-KV加強(qiáng)組、KV單獨(dú)免疫組的小鼠均獲得了100％保護(hù)(10/10)，而重組質(zhì)粒單獨(dú)免疫組小鼠保護(hù)率為80％-

6、90％(8/10-9/10)。由此說明，PRV重組質(zhì)粒初免與滅活苗加強(qiáng)的免疫策略可以明顯提高重組質(zhì)粒單獨(dú)免疫的體液和細(xì)胞免疫效果以及滅活苗的細(xì)胞免疫效果。 經(jīng)雙酶切將PRv Fa株gC基因亞克隆到5型腺病毒AdMax系統(tǒng)穿梭質(zhì)粒pDC316中，獲得pDC316-gC，與腺病毒DNA輔助質(zhì)粒pBHGlox△E1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，成功包裝出重組腺病毒Ad-gC。經(jīng)PCR鑒定和病毒空斑純化，得到純的高效價(jià)重組病毒Ad-gC。

7、間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)獲得的重組腺病毒能表達(dá)PRV gC蛋白。用重組腺病毒免疫BALB/c小鼠，結(jié)果表明能誘導(dǎo)特異性的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。一免和二免后兩周的gC蛋白抗體ELISA效價(jià)分別為7680±2862和112640±56086，病毒中和效價(jià)分別為14±4和48±18，而對(duì)照組均為陰性。二免后兩周測(cè)定DTH應(yīng)答水平，Ad-gC免疫組小鼠足墊呈現(xiàn)不同程度紅腫，與對(duì)照組足墊腫脹值相比差異極顯著(P<0.01)。用20 LD<,50> PR

8、V攻毒結(jié)果表明，Ad-gC免疫組小鼠可獲得100％保護(hù)(8/8)，對(duì)照組為0％(0/8)。 將表達(dá)PRV gC基因的重組腺病毒和重組質(zhì)粒DNA組合，免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)獲得9株穩(wěn)定分泌抗PRV gC蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(1C8、1D1、1H7、2D7、2G7、1A12、184、1H4和2C8)，其小鼠腹水抗體效價(jià)為1:2×10<'5>-1:5×10<'6>。亞類鑒定結(jié)果表明，單抗1A12、1H4、1H7、

9、2C8、2D7為IgG2a，lC8為IgG2b，184、1D1、2G7為IgGl。經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)和Western blotting分析表明，9株單抗均能與PRVgC蛋白反應(yīng)，且識(shí)別gC蛋白的線性表位。以上結(jié)果表明，重組腺病毒免疫可用于制備抗目的蛋白單克隆抗體，為制備單抗提供了一種新的免疫方法。 將腦心肌炎病毒核衣殼前體多肽P1與P12A3C串聯(lián)基因分別插入穿梭質(zhì)粒pDC316中，構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒pDC316-P1和pDC3

10、16-P12A3C，分別與輔助質(zhì)粒pBHGloxAE1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，成功包裝出重組腺病毒Ad-P1和Ad-P12A3C。獲得的重組腺病毒可穩(wěn)定傳代。免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)和Western blotting分析表明，重組病毒可表達(dá)目的蛋白。用重組腺病毒免疫小鼠，結(jié)果表明Ad-P1誘導(dǎo)的VP1特異總抗體IgG和DTH免疫水平均高于Ad-P12A3C，然而Ad-P1并不能檢測(cè)到明顯的中和抗體(<1:8)。Ad-P12

11、A3C能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的中和抗體(1:32-128)，無論一次或二次免疫后對(duì)10<'8>TCID<,50> EMCV攻毒均能獲得100％的保護(hù)(8/8)，一免后7 d小鼠即能完全抵抗EMCV病毒的攻擊。用10<'8>TCID<,50>的Ad-P1免疫小鼠2次，對(duì)10<'7>TCID<,50>EMCV攻毒可獲得100％的保護(hù)(8/8)。以上結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組腺病毒Ad-P12A3C能誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)，具有開發(fā)成EMCV重組腺病毒