腸道病毒71型3D蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)是手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)的主要病原體之一，屬小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus）成員。作為具有嗜神經(jīng)性的腸道病毒，EV71感染導(dǎo)致的臨床癥狀輕重不一，輕者僅表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足、口等處的皰疹等，而嚴(yán)重者可伴發(fā)無菌性腦膜炎、腦脊髓炎和神經(jīng)源性肺水腫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，甚至引起患兒死亡。目前重癥H

2、FMD多由EV71導(dǎo)致，其致病機(jī)制尚未明了。本課題組前期研究顯示，EV71病毒株SDLY1和SDLY107在病毒復(fù)制能力和毒力上存在差別，強(qiáng)毒株SDLY107的復(fù)制能力及毒力均大于弱毒株SDLY1;3D蛋白作為RNA依賴的RNA聚合酶，在病毒復(fù)制中具有關(guān)鍵作用。因此，本研究利用反向遺傳技術(shù)，將弱毒株SDLY1的3D編碼區(qū)置換入強(qiáng)毒株SDLY107中并拯救出重組病毒，通過體外實(shí)驗(yàn)研究3D蛋白在病毒復(fù)制能力和毒力中的作用。同時(shí)，本研究利用結(jié)

3、構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，篩選出弱毒株SDLY1和強(qiáng)毒株SDLY107的3D蛋白晶體，后期將通過X射線衍射解析其晶體結(jié)構(gòu)，為3D蛋白毒力位點(diǎn)的定位提供依據(jù)。
　　目的:
　　1.構(gòu)建并拯救重組病毒SDLY107(1-3D)，通過體外實(shí)驗(yàn)研究3D蛋白對病毒復(fù)制能力和毒力的影響。
　　2.篩選出弱毒株SDLY1和強(qiáng)毒株SDLY107的3D蛋白晶體，解析蛋白結(jié)構(gòu)并分析兩株病毒3D蛋白中的突變位點(diǎn)對蛋白結(jié)構(gòu)的影響，找出有意義的突變位點(diǎn)，為

4、3D蛋白毒力位點(diǎn)的定位提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.將弱毒株SDLY1的3D編碼區(qū)置換入強(qiáng)毒株SDLY107，利用體外轉(zhuǎn)錄獲取感染性RNA，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，盲傳3代拯救出重組病毒SDLY107(1-3D);
　　2.使用PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunofluorescence assay，IFA)對重

5、組病毒進(jìn)行鑒定，測序驗(yàn)證;使用Vero細(xì)胞收獲重組病毒，用50％終點(diǎn)法測定病毒滴度;
　　3.使用弱毒株SDLY1株、強(qiáng)毒株SDLY107株和重組病毒SDLY107(1-3D)感染RD細(xì)胞(MOI=100)，分別在37℃和39.5℃條件下培養(yǎng)，每12h收取細(xì)胞上清，使用qRT-PCR測定病毒的生長曲線，比較不同毒株復(fù)制能力的差異;
　　4.使用弱毒株SDLY1株、強(qiáng)毒株SDLY107株和重組病毒SDLY107(1-3D)感染

6、RD細(xì)胞(MOI=10)，分別在37℃和39.5℃條件下培養(yǎng)，48h后分別通過乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試驗(yàn)和CCK-8試驗(yàn)檢測不同毒株對細(xì)胞的損傷作用;
　　5.PCR擴(kuò)增SDLY1株和SDLY107株3D片段，分別將其插入原核表達(dá)載體PET32a(+)和pEGX-6P-1中構(gòu)建重組質(zhì)粒;
　　6.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli，E coli）DE3中，使用

7、IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，收集菌體進(jìn)行超聲破碎，使用親和層析、離子交換層析和分子篩層析對含有3D蛋白的上清液進(jìn)行純化，使用坐滴法篩選3D蛋白晶體。
　　結(jié)果:
　　1.重組感染性RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，接種至第3代觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，PCR、qRT-PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)和測序結(jié)果證實(shí)重組病毒SDLY107(1-3D)拯救成功;50％終點(diǎn)法得到SDLY1株、SDLY107株和SD

8、LY107(1-3D)株的CCID50分別為10-6.0/ml、10-65/ml和10-6.5/ml;
　　2.不同毒株生長曲線的測定結(jié)果顯示，37℃條件下，重組病毒SDLY107(1-3D)的復(fù)制能力略弱于SDLY107株，略強(qiáng)于SDLY1株;39.5℃條件下，SDLY107株的復(fù)制能力稍有下降，而SDLY1株和SDLY107(1-3D)的復(fù)制能力均顯著下降，SDLY107(1-3D)略強(qiáng)于SDLY1株;
　　3.LDH試

9、驗(yàn)和CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，37℃條件下，重組病毒SDLY107(1-3D)對細(xì)胞的損傷作用弱于SDLY107株，強(qiáng)于SDLY1株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);39.5℃條件下，SDLY1株和SDLY107(1-3D)對細(xì)胞的損傷作用顯著降低，SDLY107(1-3D)強(qiáng)于SDLY1株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;
　　4.PCR擴(kuò)增得到的3D片段分別插入原核表達(dá)載體PET32a(+)和pEGX-6P-1中，得到重組質(zhì)

10、粒 PET32a-3D-1、 PET32a-3D-107、 pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-107'，測序正確;
　　5.3D蛋白表達(dá)并純化后，得到了高純度、高濃度的3D蛋白樣品，PET32a-3D-1、PET32a-3D-107、pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-107'表達(dá)的3D蛋白濃度分別為14.8mg/ml、12.5mg/ml、9.0mg/ml和7.0mg/ml;
　　6.PET32

11、a-3D-1和PET32a-3D-107表達(dá)的3D蛋白未觀察到晶體生成;pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-107'表達(dá)的3D蛋白在0.4mol/L酒石酸鉀鈉條件下觀察到晶體生成。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建并拯救了重組病毒SDLY107(1-3D)，重組病毒SDLY107(1-3D)的復(fù)制能力和毒力均下降，在高溫條件下下降尤為明顯，表明3D蛋白存在影響病毒毒力的位點(diǎn)，且毒力位點(diǎn)具有一定的溫度敏感性。