簡(jiǎn)介：WHO公布2003年席卷全球的SARS爆發(fā)流行，涉及32個(gè)國(guó)家和地區(qū)，全球累計(jì)病例8422例，死亡人數(shù)919人，病死率約11％。2004年禽流感病毒甲型H5N1在南亞和東南亞爆發(fā)流行，致使超過(guò)1億只家禽被捕殺，并傳播人類(lèi)導(dǎo)致感染患者的死亡。2009年4月自墨西哥出現(xiàn)的第一例甲型H1N1流感病毒感染患者至2010年3月，該病毒的大流行已蔓延全球213個(gè)國(guó)家和地區(qū)。2010年4月，WHO公布迄今為止甲型H1N1病毒大流行已造成17000余人死亡。截至2010年3月31日，中國(guó)31個(gè)省累計(jì)報(bào)告甲型H1N1流感確診病例120000例，死亡病例超過(guò)800例。近7年新發(fā)感染性疾?。‥MERGINGINFECTIOUSDISEASE，EID）事件觸目驚心，對(duì)人類(lèi)健康、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定產(chǎn)生了巨大的影響，使人們對(duì)EID積極防控和健全相關(guān)公共衛(wèi)生安全體系產(chǎn)生了許多新的認(rèn)識(shí)，并對(duì)EID病原體給予了高度關(guān)注。目的本研究通過(guò)BDV分子流行病學(xué)調(diào)查和研究，建立中國(guó)西北伊犁地區(qū)新發(fā)病毒BDV感染動(dòng)物樣本庫(kù)，獲得BDV流行病學(xué)資料，了解不同種屬動(dòng)物BDV流行現(xiàn)狀，分析BDV可能的種系來(lái)源，為制定預(yù)防和控制BDV爆發(fā)流行預(yù)案提供可靠依據(jù)，為健全公共衛(wèi)生安全體系奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，建立BDVP40OL細(xì)胞模型，為BDV發(fā)病機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供平臺(tái)；進(jìn)一步評(píng)價(jià)BDV熒光定量PCR診斷試劑盒，為BDV流行病學(xué)調(diào)查和臨床研究提供可靠的檢測(cè)手段。方法1根據(jù)BDV感染宿主地源特殊性和種屬多樣性，選擇中國(guó)西北新疆伊犁地區(qū)作為樣本采集地點(diǎn)；伊犁馬、新疆驢、新疆雙峰駝、天山馬鹿和不同品種犬作為樣本采集動(dòng)物；外周血和腦組織作為樣本采集對(duì)象。2采用FQNRTPCR方法，檢測(cè)8個(gè)品種150例犬PBMCSBDVP24RNA基因片段。用檢測(cè)BDVP40RNA片段和質(zhì)粒PMD19BDVH1766P24標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證樣本BDVP24陽(yáng)性產(chǎn)物，排除可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性。驗(yàn)證后的陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序、核苷酸和氨基酸序列同源比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析。3在5個(gè)種屬8個(gè)品種873例動(dòng)物PBMCS中，對(duì)伊犁馬、新疆驢和哈薩克牧羊犬共檢出的19例BDVP24RNA陽(yáng)性片段，進(jìn)行BDV標(biāo)準(zhǔn)株HE80、STRAINV和H1766比對(duì)，分析核苷酸和氨基酸同源相似度，重構(gòu)基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，分析BDV可能的種系來(lái)源。4培養(yǎng)人OL細(xì)胞株細(xì)胞，用含有BDVP40基因的質(zhì)粒PEGFPN1BDVP40，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染OL細(xì)胞。通過(guò)G418篩選已轉(zhuǎn)染的0L細(xì)胞，獲得BDVP40蛋白穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)染態(tài)OL細(xì)胞。RTPCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒BDVP40基因表達(dá)；觀(guān)察GFP表達(dá)、測(cè)定IHC和ELISA，鑒定BDVP40蛋白表達(dá)。最后，建立穩(wěn)定表達(dá)BDVP40的轉(zhuǎn)染態(tài)OL細(xì)胞模型。5試劑盒評(píng)價(jià)在熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)方面，將BDVP24熒光定量PCR診斷試劑盒中試劑分裝多份一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)量。隨機(jī)取出其中2份分別置于25℃和37℃兩種溫度的恒溫水浴箱內(nèi)進(jìn)行熱處理。處理時(shí)間分別選擇3H、6H、9H、12H、24H、48H和96H共7個(gè)時(shí)間段。在相應(yīng)溫度和熱處理時(shí)間完成后，對(duì)6個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒PMD19BDVH1766P24標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)的CT值和R2值比較，評(píng)價(jià)試劑盒的熱穩(wěn)定性。在BDV檢測(cè)信度評(píng)價(jià)方面，選擇定量BDV（）OL細(xì)胞和質(zhì)粒PMD19BDVH1766P24標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行BDVP24基因片段PCR擴(kuò)增。通過(guò)比較兩種檢測(cè)對(duì)象檢出BDVP24濃度梯度的一致性，評(píng)價(jià)試劑盒病毒檢測(cè)結(jié)果信度。結(jié)果1在樣本采集方面，伊犁地區(qū)樣本采集動(dòng)物歸屬于5個(gè)種屬8個(gè)品種。種屬包括伊犁馬、新疆驢、新疆雙峰駝、天山馬鹿和犬；品種有哈薩克牧羊犬、德國(guó)牧羊犬、卡羅來(lái)納犬、西伯利亞雪橇犬、波音達(dá)獵犬、比格獵犬、德國(guó)杜賓犬和斗牛梗犬。樣本采集動(dòng)物數(shù)量合計(jì)897例，其中伊犁馬582例，新疆驢204例，新疆雙峰駝4例，天山馬鹿1例，哈薩克牧羊犬95例，德國(guó)牧羊犬28例，卡羅來(lái)納犬14例，西伯利亞雪橇犬8例，波音達(dá)獵犬6例，比格獵犬4例，德國(guó)杜賓犬3例，斗牛梗犬2例。樣本采集對(duì)象為外周血、腦組織和全腦。采集樣本的數(shù)量為外周血樣本897份、腦組織樣本1573份和全腦樣本43份。2在病毒檢測(cè)方面，在8個(gè)品種150例犬中，僅哈薩克牧羊犬檢出BDVP24片段，陽(yáng)性率為110％（1091）?；蛐蛄信c德國(guó)馬BDVHE80和德國(guó)綿羊BDVS6病毒株同源相似度分別為992％和957％，氨基酸相似度為100％和893％。親緣關(guān)系與HE80最近，其次為S6。3在種系發(fā)生學(xué)方面，19例BDVP24核苷酸序列一部分形成伊犁獨(dú)立支系，其余部分匯聚至伊犁德國(guó)瑞士混合支系。獨(dú)立支系與標(biāo)準(zhǔn)病毒株無(wú)聚合，核苷酸序列同源相似度為98％，氨基酸序列為100％；德國(guó)馬HE80匯聚混合支系，核苷酸與氨基酸序列與HE80同源相似度均為100％。4在細(xì)胞模型建立方面，用RTPCR擴(kuò)增經(jīng)PEGFPN1BDVP40轉(zhuǎn)染的OL細(xì)胞中BDVP40基因核苷酸序列片段，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳154BP處出現(xiàn)一條清晰的條帶，其大小與目的片段一致。倒置熒光顯微鏡觀(guān)察，OL細(xì)胞核GFP表達(dá)量明顯大于細(xì)胞質(zhì)（細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)243），證明了BDVP40蛋白核定位的生物學(xué)特點(diǎn)。用BDV多克隆抗體和CIC單克隆抗體檢測(cè)PEGFPN1BDVP40、PEGFPN1和正常OL細(xì)胞中BDVP40蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，前者均為陰性，后者均為弱陽(yáng)性，三者之間無(wú)差異。5在試劑盒評(píng)價(jià)方面，試劑盒熱穩(wěn)定評(píng)價(jià)顯示，經(jīng)25℃和37℃熱處理后，各溫度7個(gè)不同時(shí)間段BDVP24PCR反應(yīng)CT值之間無(wú)差異，保持正常PCR擴(kuò)增效率的熱處理持續(xù)時(shí)間范圍為3H～96H；25℃和37℃兩種溫度條件下不同時(shí)間段平均尺2值之間亦無(wú)差異。BDV檢測(cè)信度評(píng)價(jià)方面顯示，在定量BDV（）OL細(xì)胞（12個(gè)濃度梯度即100～1011）和質(zhì)粒PMD19BDVH1766P24標(biāo)準(zhǔn)品（6個(gè)濃度梯度即100～105）中，均可檢測(cè)4個(gè)濃度梯度即100、101、102和103，最低檢測(cè)濃度為103。結(jié)論1伊犁地區(qū)所采集不同種屬和品種的動(dòng)物血液和腦組織樣本量，可基本反映該地區(qū)BDV自然感染現(xiàn)狀，納入動(dòng)物性別和年齡的同質(zhì)性進(jìn)一步提高了調(diào)查結(jié)果的可靠性。在國(guó)內(nèi)外首次建立了馬科動(dòng)物快速開(kāi)顱全腦采集的新方法。2伊犁地區(qū)可能存在BDV自然感染，哈薩克牧羊犬為BDV貯存宿主，其自然感染陽(yáng)性率為110％；該地區(qū)BDV流行病毒株可能與伊犁馬BDVHE80的交叉感染和引進(jìn)德國(guó)SAXONY美利奴綿羊BDVS6病毒株的輸入感染有關(guān)。3首次提出了新疆伊犁河谷動(dòng)物宿主中可能存在地源性BDV獨(dú)立種系，形成哈薩克牧羊犬BDVKT078和KT079病毒株；同一種系BDV株在伊犁河谷不同種屬動(dòng)物間的感染，可能源于外來(lái)疫病病原體經(jīng)草原絲綢之路的傳播。4質(zhì)粒PEGFPN1BDVP40轉(zhuǎn)染人OL細(xì)胞后BDVP40基因和蛋白在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)，建立了轉(zhuǎn)染態(tài)BDVP40OL細(xì)胞模型，為探索BDVP40單一病毒蛋白在宿主中的作用和BDV致抑郁癥發(fā)病機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了有效的手段。5熒光定量BDVP24診斷試劑盒在一定范圍內(nèi)不受溫度（25℃37℃）和在該溫度下持續(xù)使用時(shí)間（3H～96H）的限制，具有較好的熱穩(wěn)定性；該試劑盒具有極高的BDV檢測(cè)信度，可檢測(cè)宿主細(xì)胞中103BDV濃度。

簡(jiǎn)介：目的探討肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志陰性肝病患者流行病學(xué)和臨床特點(diǎn)，指導(dǎo)臨床診斷和治療。方法采用臨床流行病學(xué)調(diào)查方法，回顧性分析2006年1月至2008年12月肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志陰性住院的肝病患者210例臨床資料。結(jié)果1、210例肝病患者中，藥物性肝炎41例195％、不明原因性肝病38例181％、酒精性肝病30例143％、自身免疫性肝病23例110％、肝膽外科疾病23例110％、惡性腫瘤14例67％、非酒精性脂肪肝11例52％、遺傳代謝性肝病7例33％、妊娠急性脂肪肝3例14％、其他疾病20例95％；2、自身免疫性肝病包括PBC、AIH、PSC等男女比例為0351，酒精性肝病男女比例為291，肝膽外科疾病男女比例為2291；3、自身免疫性肝病患者在46～55年齡段發(fā)病率最高391％，酒精性肝病患者在36～45歲發(fā)病率最高367％，肝膽外科疾病及腫瘤疾患發(fā)病年齡以66歲以上的老年人多見(jiàn)分別為304％、357％；4、自身免疫性肝病和肝膽外科疾病的臨床表現(xiàn)以黃疸如鞏膜黃染、尿色深為著；自身免疫性肝病瘙癢及酒精性肝病的肝掌陽(yáng)性率最高；藥物性肝病ALT、AST升高、自身免疫性肝病TBIL升高及自身免疫性肝病和肝膽外科疾病ALP、ΓGT升高的水平最為顯著。結(jié)論1、藥物性肝病發(fā)病率居本組患者之首，其次為不明原因性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病及肝膽外科疾病等；2、自身免疫性肝病以中年女性發(fā)病率最高，酒精性肝病患者集中在36～45歲的中年男性，肝膽外科及腫瘤疾患發(fā)病年齡以66歲以上的老年人多見(jiàn)；3、自身免疫性肝病患者常有明顯的黃疸、皮膚瘙癢等癥狀；酒精性肝病患者肝掌陽(yáng)性率較高；4、藥物性肝病轉(zhuǎn)氨酶升高較為顯著；5、自身免疫性肝病、惡性腫瘤、肝膽外科疾病患者膽紅素、ALP、ΓGT較其他病種明顯升高。

簡(jiǎn)介：Y761881中圓于島和嚼科大學(xué)中國(guó)箭學(xué)甜辱豫博士研究生學(xué)位論文中國(guó)協(xié)和醫(yī)科人學(xué)幻F究生院薈■穆碼，肆疆采中周協(xié)和醫(yī)科人學(xué)中周醫(yī)學(xué)科學(xué)腕腫瘤醫(yī)院博士學(xué)位論史5／32，ODDSRATIOOR612，PO01。HBVCCCDNA，作為反映病毒活躍增殖的標(biāo)志，在肝癌組和對(duì)照組的陽(yáng)性率分別是625％21／32和218％8／32，OR573，PO01。最近備受重視的HBV的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)，核苷酸1762／1764錯(cuò)義突變，進(jìn)行分析，肝癌組與對(duì)照組的突變率并無(wú)顯著性差異，OR1。54，P0。4248。結(jié)論1隨訪(fǎng)啟東377例慢性HBV感染的中年男性隊(duì)列1325年，觀(guān)察到90例發(fā)生了肝細(xì)胞癌和終末期肝硬化，占這人群的239％90／377。其中，72例為肝癌，18例為肝硬化。其發(fā)病率分別約為L(zhǎng)703／105／年及426／105／年。2巢式病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染的中年男性，HBEAG和／IBVCCCDNA所反映的HBV滴度和活躍復(fù)制狀態(tài)與肝癌的發(fā)生密切關(guān)聯(lián)OR分別為612及573P001，可作為肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)。3本病例對(duì)照研究未發(fā)現(xiàn)HBV核苷酸1762和／或1764熱點(diǎn)突變與肝癌發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)。有待進(jìn)一步的研究。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多乙型肝炎病毒相關(guān)性原發(fā)性肝癌的血清病毒學(xué)分析.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：戊型肝炎病毒HEV是戊型肝炎戊肝的病原體，隨著戊型肝炎研究的深入及診斷試劑的發(fā)展，人們對(duì)戊肝的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)不斷被突破。戊肝作為一種人畜共患病已為人們所公認(rèn)，HEV輸血傳播已得到了證實(shí)。依托更可靠的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)我國(guó)戊肝流行情況的全面重新了解十分必要。已報(bào)道的HEV核酸檢測(cè)PCR引物的靈敏度存在一定缺陷，為此，我們首先根據(jù)我國(guó)流行的HEV序列特征重新設(shè)計(jì)了一套引物。檢測(cè)結(jié)果證明，該套引物具有較好的檢出率和分析靈敏度。對(duì)多個(gè)地區(qū)HEV的分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，豬源HEV均為基因4型，而健康人群中檢出的HEV基因1、4型比例大致相當(dāng)，但臨床散發(fā)性戊肝患者絕大部分為基因4型HEV感染。分離于人和豬的基因4型HEV高度同源，表明人、豬基因4型HEV在自然界中可自由傳播而不受種屬限制?；?型HEV的變異程度明顯大于基因1型，并表現(xiàn)出一定的地域集中特點(diǎn)。利用新一代HEV診斷試劑在3省12個(gè)縣市的血清流行病學(xué)研究表明，HEV在中國(guó)已流行了相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。各地區(qū)HEV抗體陽(yáng)性率感染率從212％621％不等，相鄰地區(qū)可以有較大差異。在某一地區(qū)低烈度的靜默流行不會(huì)波及到鄰近地區(qū)。在多數(shù)地區(qū)，30歲前男、女感染率沒(méi)有明顯差別，30歲后男性明顯高于女性。HEV的感染率具有明顯的年齡積累現(xiàn)象，但不同地區(qū)的增長(zhǎng)速度不同，流行程度越高的地區(qū)隨年齡增長(zhǎng)速度越快。9縣市自然人群一年隨訪(fǎng)結(jié)果表明一年內(nèi)人群感染率均有所上升，不同地區(qū)HEV的年新感染率不同，從10％到151％不等。新感染率20歲前要低于20歲后，抗體陰轉(zhuǎn)率10歲前要高于10歲后。臨床急性戊型肝炎患者、亞臨床感染者和HEV既往感染者戊肝IGG抗體水平分別為379UML、133UML和056UML。人群戊肝IGG抗體總體水平一年間沒(méi)有明顯變化。人群中抗體反彈的個(gè)體在反彈前抗體水平最高為16UML，推測(cè)人群中保護(hù)HEV感染的抗體水平大致為16UML。在江蘇東臺(tái)、海安、張家港3地的一年臨床急性肝炎病例觀(guān)察表明，戊肝四季均有發(fā)生，冬春季為發(fā)病高峰。戊肝患者平均年齡較其他肝炎患者高，50歲以上的急性肝炎患者戊肝占50％以上。男性戊肝患者明顯多于女性，男女比例大致為51，而東臺(tái)則高達(dá)101。40歲以上人群中戊肝報(bào)告發(fā)病率為每年萬(wàn)分之一，40歲男性易感人群中戊肝報(bào)告發(fā)病率約為每年千分之一，個(gè)別地區(qū)在60歲以上時(shí)男性易感人群報(bào)告發(fā)病率高達(dá)每年千分之六，提示在高致病風(fēng)險(xiǎn)人群中使用戊肝疫苗進(jìn)行免疫保護(hù)的重要性。豬的HEV感染在我國(guó)非常普遍，平均抗體陽(yáng)性率達(dá)834％，不同地區(qū)間沒(méi)有明顯差異。血清流行病學(xué)調(diào)查表明從事豬相關(guān)職業(yè)導(dǎo)致HEV感染風(fēng)險(xiǎn)升高174，而且從事時(shí)間越長(zhǎng)，風(fēng)險(xiǎn)越高。豬場(chǎng)下游人群與上游相比也有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)。提示HEV可以通過(guò)豬密切接觸傳播到從業(yè)者，并且豬場(chǎng)廢水中的戊肝病毒可以通過(guò)水流傳播。結(jié)合豬群比人群高得多的HEV帶毒率、人源和豬源基因4型HEV的高度相似及臨床戊肝患者主要為基因4型感染，推測(cè)豬已經(jīng)成為中國(guó)戊肝的重要傳染源。獻(xiàn)血員中HEV病毒血癥者比例大約為01％02％，在某些地區(qū)能達(dá)16％。這些HEV病毒血癥者按現(xiàn)有的獻(xiàn)血員篩查策略難以排除，因此HEV可能是輸血后肝炎的潛在原因之一。于北京血站篩查到的一份基因4型HEV亞臨床感染的獻(xiàn)血員血漿，經(jīng)靜脈輸入恒河猴后，該恒河猴出現(xiàn)糞便排毒和病毒血癥，各血清學(xué)指標(biāo)陽(yáng)轉(zhuǎn)，并出現(xiàn)典型急性肝炎癥狀，轉(zhuǎn)氨酶升高，肝穿出現(xiàn)典型的肝病變，包括非特異的炎癥改變和明顯的膽汁郁積。HEV的四個(gè)基因型根據(jù)流行病學(xué)和易感宿主的差異可以分為兩個(gè)大類(lèi)，一類(lèi)為只感染人的H類(lèi)HUMAN，包括基因1型和2型；一類(lèi)為人畜共患的Z類(lèi)ZOONOSIS，包括基因3型和4型。本研究通過(guò)比較這兩類(lèi)HEV的F2AA368AA606區(qū)段，發(fā)現(xiàn)在HEV的主要免疫優(yōu)勢(shì)表位、中和位點(diǎn)以及受體結(jié)合部位AA459AA606肽段存在4個(gè)類(lèi)保守的差異位點(diǎn)，分別為SER483THR、VAL492MET、SER497THR和ALA599GLY。通過(guò)定點(diǎn)突變的重組蛋白研究表明497位氨基酸的差異導(dǎo)致了這兩類(lèi)HEV的免疫優(yōu)勢(shì)表位構(gòu)象的部分改變，而其余三個(gè)位點(diǎn)的差異對(duì)HEV表面結(jié)構(gòu)影響不大。497位氨基酸的這種差異可能構(gòu)成了H類(lèi)和Z類(lèi)HEV在流行病學(xué)上諸多差異的分子機(jī)制。

簡(jiǎn)介：目的探討慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Β3（TGFΒ3）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP1）聯(lián)合感染對(duì)體外培養(yǎng)人退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的影響，從而最終實(shí)現(xiàn)延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤(pán)退變的目的。方法單層培養(yǎng)人退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞，采用綠色熒光蛋白標(biāo)記慢病毒（GV287EGFP）評(píng)價(jià)其對(duì)髓核細(xì)胞的感染效率。應(yīng)用構(gòu)建的TGFΒ3P2ATIMP1慢病毒載體感染髓核細(xì)胞，在倒置纖維鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，通過(guò)REALTIMEQPCR技術(shù)檢測(cè)感染后TGFΒ3、TIMP1、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的MRNA表達(dá)量，通過(guò)WESTERNBLOT技術(shù)檢測(cè)感染后Ⅱ型膠原和蛋白多糖含量，最終評(píng)價(jià)應(yīng)用攜帶TGFΒ3P2ATIMP1的慢病毒載體體外感染人退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞后對(duì)其細(xì)胞外基質(zhì)代謝的影響。結(jié)果感染復(fù)數(shù)（MOI）為60時(shí)可獲較滿(mǎn)意感染效率。REALTIMEQPCR示目的基因感染組的TGFΒ3、TIMP1、Ⅱ型膠原、蛋白多糖MRNA表達(dá)量均明顯高于空病毒感染組及空白對(duì)照組（F＝16350～74378，Q2010～10620，P結(jié)論慢病毒載體介導(dǎo)的TGFΒ3和TIMP1雙基因聯(lián)合感染人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞可長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成，并最終改善髓核細(xì)胞外基質(zhì)的代謝。

簡(jiǎn)介：目的手足口病是一種流行性傳染病，多由腸道病毒引起，癥狀主要表現(xiàn)為手、足和口腔粘膜的皰疹，多數(shù)是良性、自限性疾病，也可出現(xiàn)心、肺和神經(jīng)系統(tǒng)等嚴(yán)重并發(fā)癥。我們利用對(duì)腸道病毒具有較高特異性的兼并引物和自行設(shè)計(jì)的分型引物，檢測(cè)手足口病患兒咽拭子標(biāo)本，同時(shí)，通過(guò)腸道病毒基因組VP1編碼區(qū)序列的測(cè)定和分析，研究手足口病病原體檢測(cè)和分型方法，掌握其遺傳進(jìn)化特征。人類(lèi)腸道病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，該屬包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒和腸道病毒，其中腸道病毒71型是引起手足口病最重要的病原體，由其引起的手足口病癥狀較重，常伴有無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等并發(fā)癥，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致死亡。該病毒存在較明顯的變異和重組現(xiàn)象，因此到目前為止仍沒(méi)有很好的預(yù)防和治療方法。本課題通過(guò)對(duì)腸道病毒71型VP1區(qū)序列及全基因組序列的分析，研究腸道病毒71型的變異、重組規(guī)律，為疫苗的研發(fā)、藥物靶位的篩選及防控策略的完善等提供理論基礎(chǔ)。除柯薩奇病毒A16CVA16和腸道病毒71型EV71以外，柯薩奇病毒A10CVA10、柯薩奇病毒A6CVA6也是手足口病比較常見(jiàn)的病原體。本課題通過(guò)對(duì)手足口病CVA10VP1蛋白的生物信息學(xué)研究，分析和預(yù)測(cè)該病毒VP1蛋白的理化特性、空間結(jié)構(gòu)以及該蛋白的B細(xì)胞抗原表位。方法⑴標(biāo)本采集自山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院住院手足口病患兒的咽拭子標(biāo)本。標(biāo)本加入適當(dāng)生理鹽水，劇烈振蕩洗下咽拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，自然沉淀后吸取上清液，加入適量抗生素，置4℃條件下，備用。⑵采用北京天根公司病毒RNA提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的RNA溶于60ULRNASEFREEDDH2O中，直接用于RTPCR或置20℃以下低溫保存。⑶用腸道病毒通用實(shí)時(shí)熒光RTPCR核酸檢測(cè)試劑盒同時(shí)分別進(jìn)行腸道病毒屬、EV71和CVA16型進(jìn)行分子鑒定。⑷合成對(duì)腸道病毒VP1區(qū)3’端序列具有較高特異性的兼并引物040011，同時(shí)通過(guò)檢索GENBANK中EV71和CVA10病毒基因型VP1序列，分別設(shè)計(jì)分型引物。⑸通過(guò)RTPCR方法擴(kuò)增EV71、CVA16、CVA6和CVA10病毒基因型VP1區(qū)核苷酸序列。⑹瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，利用北京天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行回收、純化。⑺回收后的DNA進(jìn)行序列測(cè)定。采用生物信息學(xué)軟件DNAMAN522和BIOEDIT7090進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。⑻使用基因重組分析軟件RDP和SIMPLOT＿V351，對(duì)EV71基因組進(jìn)行重組分析。⑼利用R4GAMIEROSGUTHPEROBSON方法、HNNHIERARCHICAL人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)法、PHD多重比對(duì)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)比對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)法、PREDAT單序列分析人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)法、SOPMA改進(jìn)型自我優(yōu)化預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)法等方法預(yù)測(cè)VP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)卷曲、Β片層、Β螺旋和Β轉(zhuǎn)角。⑽利用EXPASYAUEXPASYGTOOLS中的SWISSMODEL三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模，預(yù)測(cè)VP1蛋白的空間構(gòu)象并建模。⑾應(yīng)用DNASTAR軟件的PROTEAN，采用KYTEDOOLITTLE、KARPLUSSCHULTZ、EMINI和JAMESONWOLF對(duì)氨基酸的親水性、柔韌性、表面可能性及抗原指數(shù)進(jìn)行單參數(shù)分析。⑿用ABCPRED和DISCOTOPE服務(wù)器預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位。將單參數(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果匯總，結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲區(qū)域確定為B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。最后采用ABCPRED和DISCOTOPE驗(yàn)證表位預(yù)測(cè)結(jié)果。結(jié)果①5個(gè)EV71濟(jì)南分離株核苷酸同源性為957％991％，氨基酸同源性為987％100％。在進(jìn)化關(guān)系上，它們與EV71C4A亞型的同源性較高，核苷酸同源性為908％988％，故而屬于C4A亞型。②2個(gè)CVA16濟(jì)南分離株核苷酸和氨基酸同源性較高，分別為977％和968％。它們與CVA16B1B亞型的同源性較高，核苷酸和氨基酸的同源性分別為905％955％和968％100％。JNC07和JNB11與大部分毒株相比，無(wú)氨基酸變異位點(diǎn)出現(xiàn)。③39份腸道病毒通用型陽(yáng)性非EV71、非CVA16標(biāo)本，用040011引物擴(kuò)增后，有5例為CVA10，1例為CVA6。其余33份樣本的腸道病毒血清型待定。④利用自行設(shè)計(jì)的CVA10分型引物P16、P112擴(kuò)增上述33份血清型待定的標(biāo)本，其中4份標(biāo)本確定CVA10，核苷酸同源性為945％990％，氨基酸同源性為972％995％。⑤在線(xiàn)BLAST程序比對(duì)，JND04屬于CVA6型，與2003年，2009年報(bào)告的12個(gè)CVA6毒株核苷酸同源性為751％923％，同源性最高的是臺(tái)灣2008年的EU908152，氨基酸同源性為820％890％；氨基酸在767、773、776、777、792、806、812、824、827、841、843和845位發(fā)生變異。⑥2010年濟(jì)南市2個(gè)病毒株在P1區(qū)與EV71C型具有較高相似度SIMPLOT圖中顯示相似度80％，在2B3B區(qū)之間與B基因型相似度較高75％。3’末端這兩個(gè)病毒株與EV71各基因型代表株的相似度均不高75％。⑦JNC10與CVA10D型基因組同源性最高，核苷酸和氨基酸的同源性分別為915％976％和904％986％。測(cè)序所得VP1基因長(zhǎng)為732個(gè)核苷酸，其相對(duì)分子質(zhì)量為60580，理論等電點(diǎn)為510。VP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中以無(wú)規(guī)卷曲為主，無(wú)跨膜區(qū)域，屬于胞外蛋白。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB一個(gè)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)編號(hào)為3VBHA與VP1具有65％的序列一致性，并以此為模板，得到VP1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。最后，綜合多種抗原表位分析方法得出，JNC10VP1蛋白的B細(xì)胞抗原表位可能是1223、100110、115125、169180、195215及2202385個(gè)區(qū)段。結(jié)論⑴兼并引物040011對(duì)HEVA類(lèi)腸道病毒VP1區(qū)3’端具有較高的特異性。⑵引起手足口病的腸道病毒，除EV71和CVA16外，CVA10和CVA6也是其常見(jiàn)病原體。⑶CVA10能引起重癥手足口病和病毒性腦炎、癲癇等嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)。⑷2010年2011年濟(jì)南EV71分離株為C4A亞型，CVA16分離株為B1B亞型，CVA10分離株為D基因型，與近幾年中國(guó)大陸各基因型優(yōu)勢(shì)株流行趨勢(shì)基本一致。⑸2010年EV71濟(jì)南分離株存在基因型內(nèi)和型間雙重組現(xiàn)象。⑹CVA10VP1基因編碼蛋白存在多個(gè)抗原表位區(qū)域，可能是免疫診斷、藥物作用和疫苗研制的靶位，將為CVA10診斷、治療和預(yù)防提供參考依據(jù)。

簡(jiǎn)介：汕頭大學(xué)汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文粵東地區(qū)喘息性疾病患兒中人博卡病毒的檢出粵東地區(qū)喘息性疾病患兒中人博卡病毒的檢出與病原學(xué)研究與病原學(xué)研究IDENTIFIEDANDPATHOGENICSTUDYONHUMANBOCAVIRUSINCHILDRENWITHWHEEZINGINEASTGUANGDONGIDENTIFIEDANDPATHOGENICSTUDYONHUMANBOCAVIRUSINCHILDRENWITHWHEEZINGINEASTGUANGDONG專(zhuān)業(yè)專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)兒科學(xué)名稱(chēng)兒科學(xué)學(xué)位申請(qǐng)人周仁彬?qū)W位申請(qǐng)人周仁彬?qū)熈謴V裕師林廣裕主任主任汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院2008年5月中國(guó)汕頭目錄中文摘要中文摘要Ⅰ英文摘要英文摘要Ⅲ縮略語(yǔ)縮略語(yǔ)Ⅴ第1章前言第1章前言1第2章粵東地區(qū)喘息性疾病患兒中人博卡病毒的檢出與病原學(xué)初步研究第2章粵東地區(qū)喘息性疾病患兒中人博卡病毒的檢出與病原學(xué)初步研究321材料21材料322方法22方法523結(jié)果23結(jié)果924討論24討論2325小結(jié)25小結(jié)28第3章參考文獻(xiàn)第3章參考文獻(xiàn)29第4章綜述第4章綜述32附錄附錄38致謝致謝45發(fā)表論文情況發(fā)表論文情況46個(gè)人簡(jiǎn)介個(gè)人簡(jiǎn)介47

簡(jiǎn)介：目的了解我國(guó)健康獻(xiàn)血員隱匿性乙肝病毒感染者的流行率。探討國(guó)內(nèi)血站對(duì)獻(xiàn)血員乙型肝炎病毒表面抗原HBSAG篩查的安全性和可靠性。進(jìn)一步改進(jìn)獻(xiàn)血員HBV篩查方法，減少HBV的漏檢率；分析隱匿性乙肝感染者病毒S區(qū)，探討引起隱匿性感染的原因。方法1收集經(jīng)中心血站依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部制定的血庫(kù)安全的要求雙篩HBSAG陰性、抗HCV陰性、抗HIV陰性、梅毒螺旋體抗體陰性、谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT＜40IUML陰性的合格獻(xiàn)血員血漿2～3ML。20℃保存；2雅培ARCHITECTI2000電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)HBSAG定量；NESTPCR擴(kuò)增乙肝病毒S區(qū)、C區(qū)、X區(qū)；3NESTPCR擴(kuò)增隱匿性乙肝病毒感染者病毒PRESS區(qū)，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序并與標(biāo)準(zhǔn)病毒序列對(duì)比分析病毒株變異。結(jié)果1經(jīng)雅培ARCHITECTI2000復(fù)檢健康獻(xiàn)血員中HBSAG陽(yáng)性率為65％64983；擴(kuò)增病毒S、C、X區(qū)，609％3964至少兩個(gè)區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性；健康獻(xiàn)血員隱匿性HBV感染率為40％39983。2漏檢的樣本HBSAG滴度定量，中位數(shù)為017IUML005114IUML；HBSAG陽(yáng)性的標(biāo)本609％3964病毒擴(kuò)增陽(yáng)性，91％2564病毒擴(kuò)增陰性；HBSAG定量陽(yáng)性組中位數(shù)為015IUML005096IUML，陰性組中位數(shù)為018IUML005114IUML，病毒擴(kuò)增陽(yáng)性組與陰性組之間HBSAG定量、性別比例和轉(zhuǎn)氨酶水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3隱匿性感染者病毒載量均很低，約50～1000拷貝ML；病毒PRESS區(qū)段擴(kuò)增陽(yáng)性率359％1439；其中609％3964至少兩個(gè)區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性，296％1964S區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性，641％4164C區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性，656％4264X區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性。359％1439擴(kuò)增出病毒PRESS區(qū)段；4測(cè)序結(jié)果峰圖均一，未見(jiàn)混合感染。將S基因翻譯成氨基酸后，與GENBANK中各種基因型標(biāo)準(zhǔn)株的S區(qū)蛋白對(duì)比，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)的已有文獻(xiàn)證實(shí)可導(dǎo)致HBSAG陰性或分泌量降低的“A”決定簇變異。可見(jiàn)少數(shù)可能與HBSAG陰性相關(guān)的S區(qū)氨基酸位點(diǎn)突變S45D，N68D，Q129R，F(xiàn)134N，V180S，V190I。結(jié)論目前經(jīng)血站常規(guī)檢測(cè)HBSAG為陰性的合格血液，用敏感性更高的試劑仍能檢測(cè)出HBSAG及HBVDNA。臨床用血存在導(dǎo)致乙肝感染的風(fēng)險(xiǎn)。HBSAG分泌量處于判斷界限附近時(shí)，即使是較為精確的電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于樣本病毒陽(yáng)性和陰性也難于作出判定。造成OBI的主要原因可能由于HBV低水平復(fù)制，檢測(cè)試劑的靈敏度不夠；病毒變異導(dǎo)致HBSAG的檢測(cè)失敗。

簡(jiǎn)介：研究背景慢性丙型肝炎是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病之一。盡管目前世界范圍內(nèi)對(duì)于慢性丙肝防治理論與方法上取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但HCV感染慢性化的免疫學(xué)機(jī)制研究的不是十分透徹，持續(xù)的病毒血癥導(dǎo)致感染后丙型肝炎肝硬化、丙型肝炎肝癌的發(fā)生。免疫應(yīng)答在丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。細(xì)胞免疫功能異常可能是造成病毒持續(xù)感染的主要原因之一，尤其是淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的異常是HCV感染慢性化的重要原因。目的研究慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞上抑制性受體PD1表達(dá)情況與健康人群的差異，及在中心記憶細(xì)胞、效應(yīng)記憶性細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞表面的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)抗病毒治療后12周、48周PD1在CD4、CD8的T淋巴細(xì)胞表面及記憶性細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)情況與抗病毒治療前的差異研究CD4CD25FOXP3TREG細(xì)胞在慢性丙型肝炎患者外周血分布頻率與健康人群的差異，及抗病毒治療后12周、48周其分布頻率的變化研究HLAA2抗原在慢性丙型肝炎患者率的高低，為進(jìn)一步進(jìn)行HCV特異性肽段刺激做準(zhǔn)備研究基因1B型的HCVNS314061415及HCVNS310731081兩條肽段刺激慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞后，CD4、CD8的T淋巴細(xì)胞分泌穿孔素、顆粒酶、干擾素Γ的殺傷能力。材料和方法11選擇慢性丙型肝炎患者34例為研究對(duì)象，用肝素鈉試管收集抗病毒治療基線(xiàn)、抗病毒治療12周、48周時(shí)外周血標(biāo)本，應(yīng)用密度梯段離心法提取單個(gè)核細(xì)胞，依照CD45RA及CD27分子在CD4及CD8的T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)情況將細(xì)胞分為4群，分別是原始細(xì)胞CD4CD27CD45RA、中心記憶細(xì)胞（CD4CD27CD45RA）、效應(yīng)記憶性細(xì)胞（CD4CD27CD45RA）、效應(yīng)性細(xì)胞CD4CD27CD45RA原始細(xì)胞CD8CD27CD45RA、中心記憶細(xì)胞（CD8CD27CD45RA）、效應(yīng)記憶性細(xì)胞（CD8CD27CD45RA）、效應(yīng)性細(xì)胞（CD8CD27CD45RA）。將PECY7標(biāo)記的CD3、APCCY7標(biāo)記的CD4、PERCP標(biāo)記的CD8、APC標(biāo)記的CD45RA、FITC標(biāo)記的CD27、PE標(biāo)記的PD1抗體加入提取出的細(xì)胞內(nèi)，振蕩均勻，室溫，避光，孵育20MIN。12轉(zhuǎn)移細(xì)胞至上樣管內(nèi)，在流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD1在各群細(xì)胞的表達(dá)情況。13復(fù)蘇慢性丙型肝炎患者及健康對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞，將FITC標(biāo)記的CD4及PE標(biāo)記的CD25抗體各15ΜL，先后加入準(zhǔn)備好的含有細(xì)胞的EP管內(nèi)，同時(shí)設(shè)立同型對(duì)照。14經(jīng)過(guò)固定、破膜處理后加入胞內(nèi)染色劑APCFOXP3抗體15ΜL，室溫孵育20MIN。15轉(zhuǎn)移細(xì)胞至上樣管內(nèi)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4CD25FOXP3TREG細(xì)胞在慢性丙型肝炎患者及健康對(duì)照人群分布頻率。21同樣應(yīng)用密度梯度離心法，選取110例CHC患者外周血標(biāo)本提取單個(gè)核細(xì)胞，取FITC標(biāo)記的CD3及PE標(biāo)記的HLAA2抗體各15ΜL加入細(xì)胞，室溫、避光孵育20MIN。22將孵育好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至上樣管，流式細(xì)胞儀進(jìn)行HLAA2分型檢測(cè)。31將1105ML的細(xì)胞鋪在24孔板中，分別加入基因1B型NS314061415及NS310731081肽段和細(xì)胞共孵育24H。32將孔板中一組孔內(nèi)加入阻斷劑，另一組孔不加阻斷劑，孵育45個(gè)H后收獲細(xì)胞于15ML的EP管中，加入PECY7標(biāo)記的CD3、APCCY7標(biāo)記的CD4、PERCP標(biāo)記的CD8抗體各15ΜL加入EP管內(nèi)，振蕩均勻，室溫，避光，孵育20MIN。33將細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定、破膜處理后，將未加阻斷劑的細(xì)胞加入FITC標(biāo)記的PERFIN（穿孔素）、將加入阻斷劑的細(xì)胞內(nèi)加入PE標(biāo)記的GRAZYME（顆粒酶）B、APC標(biāo)記的INTERFERON?？贵w，室溫、避光孵育30MIN。34將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至上樣管內(nèi)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4及CD8的細(xì)胞分泌穿孔素、顆粒酶及干擾素Γ的水平結(jié)果1PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組T3837，P00007，PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組T2142，P0043PD1在CD4T淋巴的中心記憶性細(xì)胞T2498，P00213、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞T5239，P00001、效應(yīng)細(xì)胞T3634，P00014表面表達(dá)均高于健康對(duì)照組PD1在CD8T淋巴的中心記憶性細(xì)胞T3688，P00015、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞T3088，P00058、效應(yīng)細(xì)胞T4455，P00002表面表達(dá)均高于健康對(duì)照組。2慢性丙型肝炎患者治療至12周時(shí)，PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4T淋巴細(xì)胞T4108，P00002表面表達(dá)高于健康對(duì)照組，PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8T淋巴細(xì)胞T2071，P00458表面表達(dá)高于健康對(duì)照組在CD4中心記憶性細(xì)胞T2761，P00129、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞T2618，P00174、效應(yīng)細(xì)胞T2601，P00174表面表達(dá)均高于健康對(duì)照組PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8T淋巴細(xì)胞的中心記憶性細(xì)胞T2260，P00364、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞T4331，P00004、效應(yīng)細(xì)胞T4346，P00003表面表達(dá)均高于健康對(duì)照組。3慢性丙型肝炎患者治療至48周時(shí)，PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4T淋巴細(xì)胞T000302，P09702，PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8T淋巴細(xì)胞T0098，P09231表面表達(dá)與健康對(duì)照組無(wú)明顯差異PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4的中心記憶性細(xì)胞T1239，P02312、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞T08306，P04155、效應(yīng)細(xì)胞T05457，P05920表面表達(dá)均與健康對(duì)照無(wú)明顯差異，PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8中心記憶性細(xì)胞T09505，P03544、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞T03535，P07278、效應(yīng)細(xì)胞T02533，P08029表面表達(dá)均與健康對(duì)照無(wú)明顯差異與慢性丙型肝炎患者治療至12周時(shí)比較，PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4中心記憶性細(xì)胞T2441，P00252、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞T2852，P00095、效應(yīng)細(xì)胞T3079，P00065表面表達(dá)明顯降低與慢性丙型肝炎患者治療至12周時(shí)比較，PD1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8中心記憶性細(xì)胞T4849，P00001、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞T6723，P00001、效應(yīng)細(xì)胞T7569，P00001表面表達(dá)明顯降低。4CD4CD25FOXP3TREG在慢性丙型肝炎患者外周血分布頻率高于健康對(duì)照組T3569P0002。5慢性丙型肝炎患者抗病毒治療至12周時(shí)CD4CD25FOXP3TREG外周血分布頻率仍高于健康對(duì)照組T2696，P00132。6慢性丙型肝炎患者抗病毒治療至48周時(shí)CD4CD25FOXP3TREG外周血分布頻率與抗病毒治療前基線(xiàn)T3407，P00028、治療至12周時(shí)T2565，P00152比較明顯降低。7慢性丙型肝炎患者抗病毒治療基線(xiàn)外周血CD4CD25FOXP3TREG分布頻率與HCVRNA載量呈正相關(guān)R0698，P00016。8HLAA2抗原陽(yáng)性率在慢性丙型肝炎患者中分布率與健康對(duì)照組無(wú)明顯差異，陽(yáng)性率為3909％。9慢性丙型肝炎患者外周血CD4T細(xì)胞經(jīng)NS314061415肽段刺激后分泌顆粒酶BT20807，P00229干擾素ΓT2561，P00307及穿孔素T4767，P0001的水平較健康對(duì)照人群明顯降低慢性丙型肝炎患者外周血CD8T細(xì)胞經(jīng)NS314061415肽段刺激后分泌顆粒酶BT2229，P00499干擾素ΓT4598，P00018及穿孔素T2387，P00408的水平較健康對(duì)照人群明顯降低慢性丙型肝炎患者外周血CD4T細(xì)胞經(jīng)NS310731081肽段刺激后分泌顆粒酶BT2564，P00334、干擾素ΓT2633，P0003及穿孔素T2564，P00334的水平較健康對(duì)照人群明顯降低慢性丙型肝炎患者外周血CD8T細(xì)胞經(jīng)NS310731081肽段刺激后分泌顆粒酶BT3008，P00148、干擾素ΓT2922，P00192及穿孔素T2818，P00201的水平較健康對(duì)照人群明顯降低。10與健康對(duì)照組相比較，慢性丙型肝炎患者外周血CD4T淋巴細(xì)胞增殖能力低下，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與健康對(duì)照組相比較，慢性丙型肝炎患者外周血CD8T淋巴細(xì)胞增殖能力低下，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1PD1在慢性丙型肝炎患者治療前基線(xiàn)表達(dá)于外周血CD4T淋巴細(xì)胞、CD8T淋巴細(xì)胞表面及CD4T淋巴細(xì)胞、CD8T淋巴細(xì)胞中心記憶細(xì)胞、效應(yīng)記憶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞水平明顯高于健康對(duì)照組，經(jīng)抗病毒治療后連續(xù)觀(guān)察抗病毒治療至12周、48周PD1在上述各群細(xì)胞表達(dá)明顯降低，抑制性分子的表達(dá)上調(diào)反應(yīng)了慢性丙型肝炎患者體內(nèi)T細(xì)胞功能的缺陷。2外周血CD4CD25FOXP3TREG分布頻率經(jīng)抗病毒治療后亦呈現(xiàn)進(jìn)行性減少趨勢(shì)，CD4CD25FOXP3TREG可能參與了HCV感染慢性化的發(fā)病過(guò)程。3經(jīng)HCV特異性肽段刺激后，慢性丙型肝炎患者外血T淋巴細(xì)胞殺傷能力減弱，且慢性丙型肝炎患者外周血CD4T、CD8T淋巴細(xì)胞增殖能力較健康對(duì)照患者差，慢性丙型肝炎患者T細(xì)胞增殖和殺傷功能的減弱是HCV感染慢性化的重要因素。上述因素是慢性丙型肝炎患者持續(xù)病毒血癥的重要免疫學(xué)原因。

簡(jiǎn)介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文鼻咽癌高發(fā)區(qū)EB病毒環(huán)境激活物的流行病學(xué)研究及CYP1A1基因與鼻咽癌易感性的關(guān)聯(lián)分析姓名徐亞菲申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師賈衛(wèi)華20100513中山大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要示人們?nèi)粘Ｉ钏佑|的一些環(huán)境物質(zhì)或者食物中存在可以誘導(dǎo)EBV再激活的物質(zhì)，這些環(huán)境因素暴露量的差異也許是導(dǎo)致血清中EBV水平差異，進(jìn)而引起鼻咽癌發(fā)病差異的主要因素之一。但是，目前尚無(wú)來(lái)自流行病學(xué)的證據(jù)支持廣東咸魚(yú)或中草藥等對(duì)EBV存在再激活作用。大量的研究表明吸煙、飲酒、食用腌制食品、傳統(tǒng)中草藥等都和鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)，但是具體機(jī)制并不清楚。這些環(huán)境因素對(duì)EBV的再激活是否有作用目前也尚不清楚。在論文第一部分，我們通過(guò)在鼻咽癌高發(fā)區(qū)廣東省開(kāi)展大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查篩查可能的EBV環(huán)境激活物。另外，移民流行病學(xué)研究證據(jù)和復(fù)合分離分析研究結(jié)果均提示遺傳因素在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。細(xì)胞色素P450CYTOCHROMEP450，CYP是體內(nèi)代謝活化亞硝酸鹽等致癌物質(zhì)的重要代謝酶。作為CYP450超家族的亞家族之一，CYPIA遺傳多態(tài)性與頭頸腫瘤、肺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤易感性相關(guān)，是煙草前致癌物如多環(huán)芳烴和芳香烴類(lèi)等的主要代謝活化酶，可以將各種前致癌物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有致癌能力的活性中間產(chǎn)物。因此，在論文第二部分，我們以廣東鼻咽癌核心家系為研究對(duì)象，利用以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)研究探討基因CYPIA上ML位點(diǎn)和M2位點(diǎn)與鼻咽癌易感性的關(guān)系。Ⅱ

簡(jiǎn)介：背景與目的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法HIGHLYACTIVEANTIRETROVIRALTHERAPY，HAART被認(rèn)為是現(xiàn)今治療HIV／AIDS行之有效的辦法，從根本上改變了人類(lèi)HIV感染的臨床進(jìn)程。在多藥聯(lián)合應(yīng)用過(guò)程中，個(gè)體間藥代動(dòng)力學(xué)差異等諸多因素影響藥物在體內(nèi)的作用發(fā)揮。為了提高藥物的治療效果，使得藥物在有效濃度水平發(fā)揮效能，減小毒性，增大藥效，臨床開(kāi)展藥物濃度監(jiān)測(cè)，幫助個(gè)體化劑量，達(dá)到抗病毒治療理想效果。我國(guó)2003年開(kāi)始推廣免費(fèi)高效抗病毒治療，應(yīng)用國(guó)產(chǎn)仿制藥和少部分進(jìn)口藥品對(duì)感染者進(jìn)行治療，國(guó)內(nèi)大宗前瞻性研究中證實(shí)治療效果良好，為現(xiàn)今國(guó)內(nèi)臨床廣泛應(yīng)用。目前應(yīng)用于臨床的3類(lèi)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物缺少以中國(guó)人為研究對(duì)象的有效血藥濃度數(shù)據(jù)，因此本研究探討HIVAIDS患者HARRT組合藥物多劑量穩(wěn)態(tài)時(shí)的藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，探討其藥動(dòng)學(xué)規(guī)律和藥效學(xué)特點(diǎn)。對(duì)象與方法在藥動(dòng)學(xué)研究中，隨機(jī)選取北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)科門(mén)診規(guī)律隨診，HARRT超過(guò)6個(gè)月，自愿簽署知情同意書(shū)并入院的HIV／AIDS患者23人，在服藥0，05，1，15，2，3，4，6，8，10，12，145，24，265小時(shí)抽取EDTA抗凝靜脈血4ML，檢測(cè)藥物血漿濃度。按照HAART用藥種類(lèi)分組討論齊多夫定、拉米夫定、奈韋拉平和依非韋倫的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律。在藥效學(xué)研究中，隨機(jī)選取北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)科門(mén)診規(guī)律隨診，HARRT超過(guò)2個(gè)月，自愿簽署知情同意書(shū)并入院的HIVAIDS患者共計(jì)75人男38人，女37人，在服藥前和服藥后2～3小時(shí)抽取EDTA抗凝靜脈血4ML，檢測(cè)藥物血漿濃度。按照HAART用藥種類(lèi)分組研究，討論齊多夫定、拉米夫定、奈韋拉平和依非韋倫的藥效學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果在我國(guó)首先建立了3個(gè)適用于臨床HAART藥物濃度監(jiān)測(cè)的方法，方法檢測(cè)國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用的7種3大類(lèi)抗HIV藥物，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，檢測(cè)效率高，適合廣泛開(kāi)展大樣本量監(jiān)測(cè)。齊多夫定的國(guó)產(chǎn)仿制藥在體內(nèi)吸收、分布良好；AUC024，CMAX，T12顯著高于國(guó)外研究；其血漿谷濃度與血脂異常有顯著相關(guān)。中國(guó)人口服拉米夫定較國(guó)外研究TMAX長(zhǎng)，AUC024高；300MGQ24H與150MGQ12H的給藥方式血漿藥物CMIN，CMAX和AUC024未見(jiàn)顯著差異。奈韋拉平的國(guó)產(chǎn)仿制藥在體內(nèi)吸收分布良好，滿(mǎn)足3ΜGML有效治療濃度；CMIN，CMAX和AUC024均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)外研究；奈韋拉平血漿CMIN與谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶有顯著相關(guān)。依非韋倫的血藥濃度24小時(shí)滿(mǎn)足治療濃度，血漿CMAX顯著高于國(guó)外研究。結(jié)論本研究建立了3個(gè)高效液相色譜法覆蓋檢測(cè)7種抗病毒治療藥物；對(duì)于4種藥物進(jìn)行臨床藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)討論；建立完整的臨床藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)研究資料，為HARRT藥物監(jiān)測(cè)奠定基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多單純皰疹病毒Ⅰ型VP26蛋白在病毒感染過(guò)程中的分子生物學(xué)功能分析.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：目的人巨細(xì)胞病毒（HUMANCYTOMEGALOVIRUS，HCMV）感染在人群中普遍存在，HCMV感染可引起患兒的神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)的多種疾病，已成為引起新生兒疾病和先天畸形的重要感染因素之一，但HCMV先天感染的致病機(jī)制尚不清楚。1996年，CHATA等對(duì)HCMV實(shí)驗(yàn)室株AD169株、TOWNE株及一株命名為T(mén)OLEDO的低傳代分離株進(jìn)行了核酸序列比較，發(fā)現(xiàn)TOLEDO株在ULB’區(qū)含有19個(gè)在A(yíng)D169株不存在的新基因，分別命名為HCMVUL133、UL134、UL135UL151，此19個(gè)基因可能在病毒的復(fù)制、潛伏和對(duì)宿主的致病性方面起重要作用。本研究以酵母雙雜交系統(tǒng)為手段篩選與HCMVUL135蛋白相互作用人胎腦文庫(kù)的蛋白因子，進(jìn)而找出HCMV感染導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可能途徑。該研究以這一區(qū)域片段作為誘餌蛋白，從人胎腦細(xì)胞文庫(kù)中篩選與之結(jié)合的靶蛋白，為進(jìn)一步深入研究HCMV的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)材料與方法一、實(shí)驗(yàn)材料標(biāo)本為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒室保存的臨床低傳代分離株H；構(gòu)建表達(dá)載體的相關(guān)試劑；酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑；常用實(shí)驗(yàn)設(shè)備如BECKMAN臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、PERKINELMERPCR循環(huán)儀、電穿孔儀（BIAD）、全溫振蕩培養(yǎng)箱等；常用數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件如基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(kù)、凝膠成像及掃描分析軟件、引物設(shè)計(jì)軟件等。二、實(shí)驗(yàn)方法從感染了人巨細(xì)胞病毒的人胚肺中提取HCMVDNA，應(yīng)用PCR技術(shù)以HCMVDNA為模板擴(kuò)增出UL135基因的序列，將UL135擴(kuò)增產(chǎn)物與載體PGBKT7同時(shí)進(jìn)行雙酶切后純化、連接，篩選鑒定重組克?。≒GBKT7UL135），測(cè)序并分析。應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選人胎腦CDNA文庫(kù)中與HCMVUL135編碼蛋白相互作用的蛋白。1、提取文庫(kù)質(zhì)粒；2、將含有PGBKT7UL135重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中，然后再將提取的文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有PGBKT7UL135質(zhì)粒的酵母細(xì)胞AH109中；3、篩選陽(yáng)性克隆（顯色反應(yīng)及PCR技術(shù)），回轉(zhuǎn)鑒定，將與HCMVUL135相互作用的CDNA文庫(kù)基因測(cè)序；4、BLAST分析。結(jié)果采用特異性引物擴(kuò)增出HCMVUL135基因片段，片段長(zhǎng)度為987BP，并成功將HCMVUL135片段克隆到酵母系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄結(jié)合域PGBKT7上，命名為PGBKT7UL135。應(yīng)用PCR技術(shù)鑒定含PGBKT7UL135質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，然后提取PGBKT7UL135質(zhì)粒，用ECⅠ和BAMHⅠ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，測(cè)序分析顯示結(jié)果與預(yù)期一致。轉(zhuǎn)化文庫(kù)質(zhì)粒到含有PGBKT7UL135的AH109酵母細(xì)胞中并對(duì)轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了測(cè)定，在二缺平板上長(zhǎng)出260個(gè)克隆，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率026104CFUΜG，符合要求。做顯色反應(yīng)以初篩排除一些四缺培養(yǎng)基生長(zhǎng)的假陽(yáng)性克隆，有95個(gè)菌落呈藍(lán)色，將其增值并提取酵母質(zhì)粒。將提取的酵母質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后涂含AMP（氨芐青霉素）平板，PCR鑒定轉(zhuǎn)化的菌落（用文庫(kù)的上下游引物，以鑒定所轉(zhuǎn)化的是否為文庫(kù)信息），結(jié)果顯示PCR方法鑒定出陽(yáng)性克隆DNA片段大小在500BP1500BP之間，選出陽(yáng)性克隆60個(gè)，再將陽(yáng)性克隆質(zhì)?；剞D(zhuǎn)含PGBKT7UL135基因的酵母細(xì)胞AH109中，在二缺和四缺培養(yǎng)基中均生長(zhǎng)。測(cè)序及BLAST結(jié)果分析顯示有多個(gè)克隆與UL135編碼蛋白相互作用，其中2個(gè)克隆與THY1（CD90）高度同源，其同源率達(dá)到98％。結(jié)論成功應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出與HCMVUL135編碼蛋白相互作用的蛋白，其中THY1在HCMV感染致病過(guò)程中可能起重要作用。

簡(jiǎn)介：分類(lèi)號(hào)密級(jí)UDC學(xué)號(hào)406520511067南昌大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文小鼠小鼠FAPΑ基因重組腺病毒感染樹(shù)突狀細(xì)胞體內(nèi)基因重組腺病毒感染樹(shù)突狀細(xì)胞體內(nèi)抗小鼠抗小鼠LEWIS肺癌肺癌移植瘤移植瘤的免疫學(xué)研究的免疫學(xué)研究IMMUNOLOGICALSTUDYONMURINEBONEMARROWDERIVEDDENDRITICCELLSINFECTEDWITHMURINEFIBROBLASTACTIVATIONPROTEINΑRECOMBINANTADENOVIRALVECTSAGAINSTSUBCUTANEOUSTRANSPLANTATIONTUMOFLEWISLUNGCARCINOMA李環(huán)羽李環(huán)羽培養(yǎng)單位（院、系）南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院指導(dǎo)教師姓名、職稱(chēng)況九龍教授申請(qǐng)學(xué)位的學(xué)科門(mén)類(lèi)醫(yī)學(xué)學(xué)科專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)內(nèi)科學(xué)（呼吸）論文答辯日期2014年6月答辯委員會(huì)主席傅穎媛評(píng)閱人陳穎蘭熊建萍2014年6月摘要II摘要目的目的制備抗腫瘤疫苗RADFAPΑDCS，研究其抗LEWIS肺癌的預(yù)防與治療效應(yīng)。方法方法1、取C57BL6小鼠骨髓培養(yǎng)骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞，采用重組腺病毒RADFAP?。〝y帶目的基因）、RADEGFP（對(duì)照病毒）進(jìn)行感染，制備DCS疫苗并鑒定。2、制備C57BL6小鼠皮下移植瘤（LEWIS肺癌細(xì)胞）模型。3、制成的各種DCS疫苗體內(nèi)抗小鼠LEWIS肺癌的免疫學(xué)研究（1）預(yù)防實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組，各組小鼠先分別接種疫苗（RADFAPΑDCS）、RADEGFPDCS、DCS，每周1次，共3次后，再在小鼠右肋腹側(cè)接種LEWIS肺癌細(xì)胞，觀(guān)察成瘤情況及小鼠的生存率；（2）治療實(shí)驗(yàn)即各組小鼠先在右肋腹側(cè)皮下接種LEWIS肺癌細(xì)胞后，隨機(jī)分為3組，再分別接種RADEGFPDCS、RADFAPΑDCS、DCS，每周1次，共3次，觀(guān)察皮下腫瘤體積及小鼠的生存率。結(jié)果結(jié)果WESTERNBLOT顯示RADFAPΑDCS表達(dá)鼠成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）。表明RADFAPΑDCS制備成功。CAF的WESTERNBLOT結(jié)果與其免疫組化結(jié)果相一致，說(shuō)明C57BL6小鼠皮下移植瘤模型的腫瘤微環(huán)境中存在FAP。在預(yù)防實(shí)驗(yàn)中通過(guò)56天的觀(guān)察免疫接種RAD一FAPΑDCS的小鼠產(chǎn)生了明顯的抗LEWIS肺癌的效果導(dǎo)致了小鼠的生存期延長(zhǎng)與免疫接種RAD一EGFPDCS的小鼠或免疫接種DCS的小鼠生存率比較有顯著差異KAPLANMEIER分析P005。應(yīng)用RAD一FAPΑDCS疫苗雖可抑制腫瘤生長(zhǎng)但并不能清除腫瘤荷瘤小鼠死于腫瘤。在治療實(shí)驗(yàn)中，用RAD一FAPΑDCS疫苗治療能顯著抑制LEWIS肺癌的生長(zhǎng)在24天的觀(guān)察期內(nèi)皮下接種RAD一FAPΑDCS治療對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用非常明顯第10天起P005。