人巨細(xì)胞病毒UL135基因編碼蛋白的生物學(xué)功能研究.pdf

1、目的：
　　 人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染在人群中普遍存在，HCMV感染可引起患兒的神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)的多種疾病，已成為引起新生兒疾病和先天畸形的重要感染因素之一，但HCMV先天感染的致病機制尚不清楚。1996年，Cha TA等對HCMV實驗室株AD169株、Towne株及一株命名為Toledo的低傳代分離株進(jìn)行了核酸序列比較，發(fā)現(xiàn)Toledo株在UL/b’區(qū)含有19個在AD169株不

2、存在的新基因，分別命名為HCMV UL133、UL134、UL135…UL151，此19個基因可能在病毒的復(fù)制、潛伏和對宿主的致病性方面起重要作用。本研究以酵母雙雜交系統(tǒng)為手段篩選與HCMV UL135蛋白相互作用人胎腦文庫的蛋白因子，進(jìn)而找出HCMV感染導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可能途徑。該研究以這一區(qū)域片段作為誘餌蛋白，從人胎腦細(xì)胞文庫中篩選與之結(jié)合的靶蛋白，為進(jìn)一步深入研究HCMV的致病機制奠定基礎(chǔ)。
　　 實驗材料與方法：

3、>　　 一、實驗材料
　　 標(biāo)本為中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒室保存的臨床低傳代分離株H；構(gòu)建表達(dá)載體的相關(guān)試劑；酵母雙雜交實驗相關(guān)試劑；常用實驗設(shè)備如BECKMAN臺式低溫高速離心機、Perkin Elmer PCR循環(huán)儀、電穿孔儀（BioRad）、全溫振蕩培養(yǎng)箱等；常用數(shù)據(jù)庫及分析軟件如基因組數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫、凝膠成像及掃描分析軟件、引物設(shè)計軟件等。
　　 二、實驗方法
　　 從感染了人巨細(xì)胞病毒的

4、人胚肺中提取HCMV DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)以HCMV DNA為模板擴增出UL135基因的序列，將UL135擴增產(chǎn)物與載體pGBKT7同時進(jìn)行雙酶切后純化、連接，篩選鑒定重組克?。╬GBKT7-UL135），測序并分析。
　　 應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選人胎腦cDNA文庫中與HCMV UL135編碼蛋白相互作用的蛋白。1、提取文庫質(zhì)粒；2、將含有pGBKT7-UL135重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中，然后再將提取的文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到

5、含有pGBKT7-UL135質(zhì)粒的酵母細(xì)胞AH109中；3、篩選陽性克?。@色反應(yīng)及PCR技術(shù)），回轉(zhuǎn)鑒定，將與HCMV-UL135相互作用的cDNA文庫基因測序；4、BLAST分析。
　　 結(jié)果：
　　 采用特異性引物擴增出HCMV UL135基因片段，片段長度為987bp，并成功將HCMV UL135片段克隆到酵母系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄結(jié)合域pGBKT7上，命名為pGBKT7-UL135。應(yīng)用PCR技術(shù)鑒定含pGBKT7-UL1

6、35質(zhì)粒的陽性克隆，然后提取pGBKT7-UL135質(zhì)粒，用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，測序分析顯示結(jié)果與預(yù)期一致。
　　 轉(zhuǎn)化文庫質(zhì)粒到含有pGBKT7-UL135的AH109酵母細(xì)胞中并對轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了測定，在二缺平板上長出260個克隆，計算轉(zhuǎn)化效率=0.26×104cfu/μg，符合要求。做顯色反應(yīng)以初篩排除一些四缺培養(yǎng)基生長的假陽性克隆，有95個菌落呈藍(lán)色，將其增值并提取酵母質(zhì)粒。
　　

7、將提取的酵母質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后涂含Amp（氨芐青霉素）平板，PCR鑒定轉(zhuǎn)化的菌落（用文庫的上下游引物，以鑒定所轉(zhuǎn)化的是否為文庫信息），結(jié)果顯示PCR方法鑒定出陽性克隆DNA片段大小在500bp-1500bp之間，選出陽性克隆60個，再將陽性克隆質(zhì)?；剞D(zhuǎn)含pGBKT7-UL135基因的酵母細(xì)胞AH109中，在二缺和四缺培養(yǎng)基中均生長。測序及BLAST結(jié)果分析顯示有多個克隆與UL135編碼蛋白相互作用，其中2個克隆與Thy-1（CD90