人巨細(xì)胞病毒潛伏感染相關(guān)基因UL138轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件鑒定及功能研究.pdf

1、目的：人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)先天感染危害巨大，并引起免疫抑制患者致死性感染。其危害主要來自于潛伏病毒在孕期及免疫缺陷等特定時期的再激活。搞清病毒潛伏狀態(tài)維持及再激活機(jī)制并建立有效的病毒再激活控制手段是預(yù)防HCMV危害的關(guān)鍵。目前，已經(jīng)證明HCMV潛伏感染過程中UL138基因處于高表達(dá)狀態(tài)，并與病毒潛伏感染的形成與維持密切相關(guān)。UL138基因位于與HCMV病毒致病密切相關(guān)的UL/b'區(qū)，在臨床

2、株或低傳代分離株中具有潛伏感染特性。在不同細(xì)胞環(huán)境下，UL138可在活動性感染或潛伏感染時相均可表達(dá)。UL138轉(zhuǎn)錄本是多順反子結(jié)構(gòu)，所表達(dá)的蛋白有利于病毒的潛伏感染。目前有關(guān)pUL138的轉(zhuǎn)錄調(diào)控已有研究報(bào)道，但有關(guān)UL138基因具體轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究對UL138基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究，有助于闡明UL138在HELF細(xì)胞感染中高表達(dá)機(jī)制。
　　方法：采用熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)檢測實(shí)驗(yàn)及競爭性電泳遷移率變動分析實(shí)驗(yàn)(

3、electrophoretic mobility shift assay，EMSA)篩選鑒定UL138基因上游有啟動子活性的核心序列和其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，BAC技術(shù)構(gòu)建調(diào)控序列缺失突變株研究啟動子活性區(qū)的功能并用Northern blot技術(shù)檢測啟動子缺失對UL138基因1.4kb轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的影響，通過Western blot方法檢測在HCMV感染的HELF細(xì)胞中Ap-1蛋白表達(dá)水平的變化，繪制了HCMV Han BAC在轉(zhuǎn)染與該調(diào)控序列

4、結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子Activator protein1(Ap-1) siRNA以及模擬轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體的HELF細(xì)胞和HCMV Han-BAC/△UL138p感染HELF細(xì)胞中的病毒生長曲線驗(yàn)證鑒定出的調(diào)控序列對病毒復(fù)制的影響。
　　結(jié)果：⑴應(yīng)用pGL3熒光素酶報(bào)告載體，采用5'端缺失突變技術(shù)構(gòu)建UL138基因5'非編碼區(qū)不同序列的熒光素酶報(bào)告載體，確定了一個33bp的正調(diào)控元件。構(gòu)建異源啟動子質(zhì)粒證實(shí)調(diào)控元件對其具有調(diào)控作用，啟動子活性

5、。⑵競爭性EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HELF和Thp-1細(xì)胞核蛋白中含有正調(diào)控序列的特異性結(jié)合蛋白，正調(diào)控序列區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子Ap-1的結(jié)合位點(diǎn)，并與之特異性結(jié)合。⑶BAC技術(shù)成功構(gòu)建UL138基因上游調(diào)控序列缺失突變株Han BAC/△UL138p，Northernblot檢測出缺失啟動子調(diào)控序列區(qū)及用siRNA干擾轉(zhuǎn)錄因子Ap-1后UL138基因1.4kb轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)減少。⑷Western blot結(jié)果表明在HCMV感染的HELF細(xì)胞中，Ap-

6、1蛋白表達(dá)在24小時增加，隨感染時間延長，表達(dá)水平減少。⑸病毒生長曲線結(jié)果顯示滴度在接毒后24-72小時3組相比區(qū)別不明顯。而隨著感染時間延長到96小時，HCMV Han-BAC/△UL138p的病毒滴度是Han-BAC的2.5倍，而與轉(zhuǎn)染siRNA of AP-1后感染Han-BAC無明顯差異。
　　結(jié)論：①通過熒光素酶報(bào)告基因檢測技術(shù)證實(shí)了UL138基因1.4kb轉(zhuǎn)錄本上游非編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性，確定了一個33bp有啟動活性的正調(diào)