人巨細(xì)胞病毒UL136編碼蛋白相互作用蛋白的篩選和功能研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文人巨細(xì)胞病毒UL136編碼蛋白相互作用蛋白的篩選和功能研究姓名：崔鑫申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)；兒科指導(dǎo)教師：孫崢嶸201205。／構(gòu)建西GBKT7ULl36重組質(zhì)粒，PCR鑒定，并測序分析驗證。2、將pGBKT7。ULl36重組質(zhì)粒與人胎腦eDNA文庫質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株AHl09中，涂布于二缺(SD／Leu／Trp)及四缺(SD／Lcu／Trp／His／Ade)平板上，30“C培養(yǎng)至菌落長出，以Xg甜

2、篩選藍(lán)色的陽性克隆。3、提取酵母陽性質(zhì)粒。電窒至壘整化到大腸桿菌TGl中，在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中篩選出含eDNA文庫的陽性克隆。進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗證，觀察其在四缺培養(yǎng)基上的生長狀況。4、鑒定后的陽性克隆進(jìn)行測序，經(jīng)Genbank生物信息學(xué)軟件進(jìn)行BLAST分析。最終篩選出的文庫質(zhì)粒為pACT2ATPlBl。(二)Pulldown技術(shù)鑒定l、利用EcoRl和Xhol兩種限制性內(nèi)切酶，酶切文庫質(zhì)粒pACT2ATPlBl，克隆到同時雙酶切的含有GS

3、T標(biāo)簽的pGEX4T2載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEXATPlBl。2、利用TNT體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，將pGBKT7ULl36重組質(zhì)粒作為捕獲蛋白進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；提取在大腸桿菌中表達(dá)的pGEXATPlBl蛋白，作為誘餌蛋白將其固相化到MagneGSTTMParticles上，按照MagneGSTTMPulldownSystem操作進(jìn)行，將兩種蛋白共同孵育，洗脫，純化，Westernblot技術(shù)分析相互作用的蛋白復(fù)合物，ECL化學(xué)發(fā)光法鑒定結(jié)果，

4、分析。(三)激光共聚焦技術(shù)的細(xì)胞定位分析1、將含有EcoRl和BamHl粘性末端的ULl36基因片段，克隆到同時雙酶切的含有綠色免疫熒光標(biāo)記的pEGFPC1載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFPULl36：采用同樣的方法將篩選得到的文庫質(zhì)?？寺〉胶屑t色免疫熒光標(biāo)記的pDsRedC1載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pDsRedATPlBl。并測序分析驗證。2、培養(yǎng)人胚腎293T細(xì)胞。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將pEGFPULl36和pDsRedATPlBl共轉(zhuǎn)