乙型肝炎病毒主S蛋白相互作用蛋白-醛縮酶B驗(yàn)證及功能研究.pdf

1、目的：證實(shí)醛縮酶B作為乙型肝炎病毒主S蛋白結(jié)合蛋白一種候選蛋白,探討醛縮酶B生物學(xué)功能。
　　 方法：
　　 (1)以人HEPG2細(xì)胞RNA為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增出ALDOB基因。將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)真核載體PCMV5內(nèi)，構(gòu)建含ALDOB基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。以實(shí)驗(yàn)室重組全S質(zhì)粒為模板，利用PCR擴(kuò)增主S蛋白基因,構(gòu)建PCMV4-Flag-主S基因表達(dá)質(zhì)粒，分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，用免疫熒光和Weste

2、rn blot等方法檢測ALDOB及主S在293FT細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 (2)將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，激光共聚焦試驗(yàn)明確主S蛋白和醛縮酶B空間定位。將主S基因表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞,構(gòu)建主S穩(wěn)轉(zhuǎn)株,通過免疫共沉淀方法，驗(yàn)證主S蛋白與醛縮酶B相互結(jié)合。
　　 (3)構(gòu)建靶向醛縮酶B重組干擾質(zhì)粒siALDOB-Pu6,導(dǎo)入HEPG2細(xì)胞中，篩選出干擾質(zhì)粒的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)

3、驗(yàn)，探討ALDOB在肝癌細(xì)胞HepG2生長、侵襲、凋亡等方面的作用。
　　 結(jié)果：
　　 (1)核酸序列分析的結(jié)果表明，克隆的ALDOB基因與主S基因在GenBank中分別與已登記基因序列100％同源。免疫熒光結(jié)果顯示：ALDOB蛋白在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；主S蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。Western blot結(jié)果顯示：在約40KD位置有目的條帶，與預(yù)期的重組ALDOB蛋白大小一致；在約26KD位置有預(yù)期的主S蛋白表達(dá)。
　　

4、 （2）通過免疫共沉淀方法，成功確認(rèn)醛縮酶B是乙型肝炎病毒主S蛋白結(jié)合蛋白一種候選蛋白。
　　 （3）特異性抑制ALDOB表達(dá)的HepG2細(xì)胞株較沒有抑制ALDOB的HepG2細(xì)胞株，細(xì)胞增殖加快、侵襲能力增強(qiáng)、凋亡率增加。穩(wěn)定干擾ALDOB的HepG2細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株較穩(wěn)轉(zhuǎn)空載Pu6的HepG2細(xì)胞株生長。
　　 結(jié)論：
　　 （1）成功構(gòu)建了含ALDOB基因以及主S基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 （2）醛縮酶