肝炎病毒檢測條件的優(yōu)化及藻膽蛋白相互作用研究.pdf

1、第一部分:病毒性肝炎是對人類健康危害嚴重的傳染病之一。由于HBV和HCV混合感染不僅是原發(fā)性肝癌發(fā)生的原因，也是導致肝組織纖維變，加快向肝硬化發(fā)展的重要因素。所以研究HBV、HCV的病理機制為臨床早期抗病毒干預治療，控制肝組織纖維化進程，提供了理論依據(jù)，對肝癌防治具有重要意義。
　　 一般對HBV和HCV檢測有免疫學方法和核酸檢測法，免疫學方法主要包括放射性標記免疫分析技術、酶免技術分析（ELISA）、時間分辨熒光免疫分析（TR

2、FIA）和化學發(fā)光免疫分析（CLIA）等；核酸檢測方法主要有斑點雜交技術和PCR技術，其中PCR技術檢測存在假陽性和假陰性的情況，本實驗通過優(yōu)化PCR的檢測條件達到快速靈敏檢測，降低假陽性和假陰性的目的。
　　 本實驗用已經(jīng)構建好的pGEM-T-HBV（C區(qū)/C基因）和pGEM-T-HCV（核心蛋白）作為PCR檢測的質(zhì)粒模板，通過改變Mg2+濃度、退火溫度以及采用不同的酶進行PCR檢測條件的優(yōu)化。其中檢測HBV病毒時共設了1.5

3、μl-4.0μl共6個Mg2+濃度梯度，設了58.0~62.0℃共12個溫度梯度，質(zhì)粒模板稀釋濃度從10-1-10-9共9個濃度梯度。檢測HCV病毒時，共設了1.5~2.0μl共6個Mg2+濃度梯度，設了56.0~60.0℃共12個溫度梯度，質(zhì)粒模板稀釋濃度從10-1~10-9共9個濃度梯度。實驗結果證明檢測HBV病毒時，4.0μl為最佳Mg2+濃度，59℃為最佳退火溫度，天源公司的Taq DNA聚合酶靈敏性最高，對質(zhì)粒濃度的要求達到1

4、0-9。當檢測HCV病毒時，1.5μl為最佳Mg2+濃度，57℃為最佳退火溫度，Bio-Rad公司的iTaq聚合酶靈敏性最高，對質(zhì)粒濃度的要求達到10-6。
　　 第二部分:藻膽體(phycobilisome)是存在于藍藻和紅藻中的一類捕光蛋白復合物，它由藻膽蛋白（phycobiliprotein）和連接蛋白組成。藻膽蛋白由藻膽色素（phycobilin）與相應的脫輔基蛋白中保守性半胱氨酸的巰基以硫醚鍵共價結合而成。藻膽蛋白是一

5、類結構相似的色素蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)了一種能催化β-CPC84、β-PEC84、α-APC82和β-APC82位半胱氨酸殘基與PCB連接的裂合酶基因cpeS，其編號為alr0617。為了研究PCB與層理鞭枝藻藻紅藍蛋白連接的機制β亞基（β-PEC）第84位Cys連接機制，現(xiàn)通過同源性分析，篩選出四個同源性較高的基因片段，即alr0617，all5339， all5292，alr0647?，F(xiàn)根據(jù)國際標準，將編號為alr0617，all5339

6、，all5292，alr0647基因編碼的蛋白命名為CpeS1，CpeT1，CpeS2，CpeT2, CpeT1能分別與CpeT2、CpeS1、PecE形成比較明顯的復合物，但是只有CpeT1與CpeT2之間形成大約1：1的復合物。
　　 本研究成功構建質(zhì)粒pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、pBT- CpeT2、pBT- 3357、pTRG- CpeS1、pTRG- CpeT1、、pTRG- 3357基因。
　　

7、 將pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、、pBT- CpeT2、pBT- 3357和pTRG- CpeT1；pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、pBT- CpeT2和pTRG- 3357；pBT- CpeS2、、pBT- CpeT2和pTRG- CpeS1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用細菌雙雜交系統(tǒng)，證明pBT- CpeT2、pBT-CpeS2、pBT-CpeS1和pBT-3357的重組子 與pTRG-CpeT1的重組子有相互作