草魚呼腸孤病毒VP7蛋白相互作用蛋白基因的篩選.pdf

1、草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus，GCRV)是引起草魚出血病的主要病原嚴(yán)重影響我國草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。深入了解病毒和宿主之間相互作用的機(jī)制，找到其相互作用的蛋白，對(duì)于草魚病毒性出血病的防治和分子水平上揭示病毒的致病機(jī)理具有重要的意義。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行了相互作用蛋白基因篩選的初步工作。
　　本實(shí)驗(yàn)草魚呼腸孤病毒GCRV096株，為本實(shí)驗(yàn)室保種。對(duì)推測(cè)為介導(dǎo)病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞的蛋白VP7成功構(gòu)建了融合質(zhì)粒

2、。利用同源擴(kuò)增法獲得vp7 ORF，在vp7ORF引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，定向連接載體pGBKT7質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定、測(cè)序，確定成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-vp7。提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGlod，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基鑒定VP7無自激活性，可用于酵母雙雜交系統(tǒng)，并獲得重組菌株Y2HGlod[pGBKT7-vp7]。
　　利用SMART(Switching Mechanism

3、At5’end of the RNA Transcript，SMART)技術(shù)以同源重組的方式構(gòu)建了草魚頭腎細(xì)胞CIK(Ctenopharyngodon idellus kidney，CIK)細(xì)胞全長cDNA文庫。將純化后的雙鏈cDNA與線性質(zhì)粒pGADT7-Rec，carrierDNA混合，共轉(zhuǎn)化酵母文庫菌株Y187，涂布一定數(shù)量SD-Leu缺陷培養(yǎng)基后共收集文庫菌液500 mL。經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)文庫濃度為3.5×108 cfu/mL，

4、可用于下一步的文庫篩選研究。
　　將重組菌株Y2HGlod[pGBKT7-vp7]和1mL文庫菌株Y187融合，經(jīng)DDO，QDO篩選后，得到2個(gè)與VP7相互作用的陽性克隆。經(jīng)過測(cè)序得到M1，M2兩個(gè)cDNA片段，其大小分別為288 bp，534 bp。在GenBank中比對(duì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M1與斑點(diǎn)叉尾鲴和櫛孔扇貝核糖體蛋白S20同源性分別為89％和85％，M2與推測(cè)的斑馬魚真核翻譯起始因子eIF3b同源性為92％，為進(jìn)一步找到完整