RNA基因干擾技術(shù)抑制草魚呼腸孤病毒復(fù)制的研究.pdf

1、草魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種，其產(chǎn)量占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量20％。草魚出血病是草魚魚種階段最為嚴(yán)重的疾病，該病發(fā)病季節(jié)長，流行范圍廣，死亡率高，其病原為草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）。草魚呼腸孤病毒已被證實(shí)是致病力最強(qiáng)的水生呼腸孤病毒，到目前為止，已報(bào)道的草魚呼腸孤分離株有20多株。根據(jù)目前已有研究，草魚呼腸孤病毒主要有三種基因型，不同基因型的毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性均小于30％，而同一基因型的毒株核

2、苷酸和氨基酸序列的同源性均大于95％。不同分離株在基因組帶型、基因組序列、對草魚的致病能力、致細(xì)胞病變能力等方面有一定的差異。草魚呼腸孤病毒存在不同的基因型也給草魚出血病的防治帶來了困難。目前，草魚出血病的預(yù)防和治療主要依賴疫苗免疫預(yù)防與天然植物藥物治療等方法，但效果有限。分離鑒定草魚呼腸孤病毒流行毒株，探索新的草魚出血病預(yù)防與控制技術(shù)具有較大的科學(xué)意義與應(yīng)用價(jià)值。本研究針對草魚出血病開展了草魚呼腸孤病毒流行株的分離鑒定和運(yùn)用RNA干擾

3、(RNAinterference，RNAi)技術(shù)抑制草魚呼腸孤病毒的復(fù)制相關(guān)研究，主要結(jié)果如下:
　　 1.草魚呼腸孤病毒流行毒株的分離鑒定:從湖北患典型草魚出血病的草魚體內(nèi)分離到一株新致病型草魚呼腸孤病毒，暫命名為GCRV-104。采用細(xì)胞培養(yǎng)分離的技術(shù)，分離并純化病毒，經(jīng)人工感染試驗(yàn)、電鏡超微觀察、病毒的理化特性分析及病毒的基因組分析，確認(rèn)該分離株屬于草魚呼腸孤病毒Ⅲ型。用該病毒進(jìn)行人工感染健康草魚，可復(fù)制出自然發(fā)病類似癥狀

4、;病毒感染草魚腎臟細(xì)胞系(CIK)可以產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變。病毒感染細(xì)胞的超薄切片電鏡觀察結(jié)果顯示，病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制，呈晶格狀排列，雙層衣殼，無囊膜，直徑約60-70nm;凍融、氯仿、乙醚、56℃1h處理對病毒滴度影響不顯著，65℃1h處理病毒滴度下降顯著。病毒基因組SDS-PAGE分析和核酸敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，其基因組由11個(gè)分段的RNA核酸節(jié)段組成，為典型的水生呼腸孤病毒基因組結(jié)構(gòu)。病毒基因組S8節(jié)段全長基因的克隆測序分析其全長核苷

5、酸數(shù)目為1319bp編碼VP6蛋白，與Genbank中登錄的草魚呼腸孤病毒分離株GCRV-873，GCRV-991，GCRV-875，GCRV-876的氨基酸序列的同源性僅為22.6％。該流行毒株的分離鑒定為研究草魚出血病的流行病學(xué)、診斷方法與防治技術(shù)提供了重要的病原材料。
　　 2.真核表達(dá)載體介導(dǎo)的siRNA抑制草魚呼腸孤病毒的復(fù)制:針對草魚出血病呼腸孤病毒(GCRV-JX09-01)分節(jié)段基因組L2片段上的RNA聚合酶基因

6、(RdRp)和S10片段上的外衣殼蛋白基因(OCP)，設(shè)計(jì)并合成可轉(zhuǎn)錄為siRNA結(jié)構(gòu)的DNA分子，利用在合成的DNA分子上引入的限制性酶切位點(diǎn)，將合成的DNA分子克隆到pSilencer真核表達(dá)載體中，構(gòu)建含有siRNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄載體pSi-1286，pSi-117，經(jīng)PCR鑒定及測序分析確認(rèn)重組載體的正確性。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法用重組載體轉(zhuǎn)染草魚腎臟組織細(xì)胞(CIK)，并用感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.01的GCRV感染CIK細(xì)胞，分別通過細(xì)

7、胞病變效應(yīng)(CPE)、real-time RT-PCR、病毒滴度測定來評定載體轉(zhuǎn)錄siRNA對GCRV在CIK細(xì)胞中復(fù)制的影響情況。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的siRNA載體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA可以(
　　 )有效抑制CIK中GCRV的復(fù)制，病毒滴度下降，干擾組GCRV mRNA的水平僅為病毒陽性對照組的11.22％和26.86％，而陰性對照組沒有明顯的抑制效果。該結(jié)果說明真核表達(dá)載體介導(dǎo)的siRNA可以作為抑制GCRV感染和復(fù)制的新途徑。

8、
　　 3.siRNA多表達(dá)載體抑制不同基因型GCRV分離株的復(fù)制:為了實(shí)現(xiàn)RNA干擾可以同時(shí)抑制不同基因型草魚呼腸孤分離株的復(fù)制，本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建了同時(shí)靶向流行株GCRV-JX09-01(GCRVⅠ型)及GCRV-104(GCRVⅢ型)的siRNA多表達(dá)載體，pMultisiVP2/2（靶向GCRV-JX09-01和GCRV-104的VP2蛋白基因）;pMultisiVP6/7（靶向GCRV-JX09-01 VP7蛋白基因和G

9、CRV-104 VP6蛋白基因）。兩個(gè)siRNA多表達(dá)載體均可同時(shí)抑制GCRV-JX09-01和GCRV-104在CIK細(xì)胞上的復(fù)制，并且無明顯的細(xì)胞毒性。轉(zhuǎn)染pMultisiVP2/2組，GCRV-JX09-01、GCRV-104 VP2mRNA拷貝數(shù)分別下降為10.98±2.5％，10.16±3.1％;轉(zhuǎn)染pMultisiVP6/7組GCRV-JX09-01 VP7、GCRV-104 VP6 mRNA拷貝數(shù)分別下降為19.37±3.