草魚呼腸孤病毒感染對草魚細胞RNAi信號通路激活方式的影響.pdf

1、草魚是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種之一,約占我國總養(yǎng)殖量的23％。引起草魚出血病的草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)流行廣、危害大、發(fā)病季節(jié)長,致死率高,是我國淡水養(yǎng)殖中最為突出的問題之一。目前對該病毒還沒有有效防治的藥物或方法,因而進行抗草魚呼腸孤病毒的研究具有重要意義。
　　RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種由小干擾 RNA(small interfering RNA,si

2、RNA)介導(dǎo)的基因沉默途徑,它廣泛存在于各種生物中,具有高度特異性和高效性,可以用來作為抑制病毒表達的工具。
　　本文主要的研究是草魚腎細胞(Ctenopharyngodon idellus kidney cells,CIK)中GCRV的感染對 RNAi信號通路激活方式的影響,主要分以下幾個方面:
　　1、驗證 CIK中是否存在 RNAi。
　　將質(zhì)粒 pEGFP-N1和體外人工合成的egfp(熒光蛋白基因)特異的雙鏈

3、RNA(EGFP-dsRNA)共轉(zhuǎn)染到 CIK細胞中。48h后,用熒光顯微鏡觀察 EGFP蛋白的熒光強度,實時定量 PCR(qRT-PCR)檢測 egfp mRNA的表達量,以及用以 DIG標記的egfp RNA探針進行 Northern Blot檢測是否有egfp特異的小分子 RNA生成。結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pEGFP-N1與 EGFP-dsRNA的EGFP蛋白的熒光強度很弱，egfp mRNA的表達量也很低,而且產(chǎn)生了 egfp特

4、異的小分子 RNA,但是共轉(zhuǎn)染S10(GCRV第10條基因組片段)特異的dsRNA(S10-dsRNA)和pEGFP-N1的熒光強度很強,egfp mRNA的表達量也很高,而且沒有產(chǎn)生 egfp特異的小分子 RNA。這些結(jié)果說明 CIK細胞中存在著 RNAi。
　　2、GCRV感染對 CIK細胞中 RNAi信號通路激活方式的影響,共分三個方面。
　?、傺芯苛?GCRV裸鏈 dsRNA基因組與 RNAi的相互作用。將GCRV的

5、裸鏈基因組 dsRNA和人工合成的S10-dsRNA,分別轉(zhuǎn)染入 CIK細胞,用DIG標記的S10 RNA作為探針,進行 Northern Blot用來檢測 S10特異的小分子 RNA的生成水平。結(jié)果顯示,未被 GCRV感染的CIK細胞,分別轉(zhuǎn)染 GCRV的裸鏈 dsRNA和S10-dsRNA都產(chǎn)生了 S10序列特異的小分子 RNA,但是 GCRV感染組沒有特異的小分子 RNA的產(chǎn)生,初步推斷 GCRV裸鏈基因組對 Dicer蛋白敏感,

6、而 GCRV的感染能夠保護基因組 dsRNA不被 RNAi降解成病毒特異的小分子 RNA;
　　②研究 GCRV的感染對 siRNA介導(dǎo)的基因沉默的影響。將人工合成的egfp特異的siRNA(EGFP-siRNA)與 pEGFP-N1共轉(zhuǎn)染到 GCRV感染過的CIK細胞中,轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡下觀察 EGFP蛋白的熒光強度,以及用qRT-PCR檢測細胞總mRNA中 egfp mRNA的表達情況。結(jié)果顯示,GCRV感染的CIK細胞

7、中共轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和EGFP-siRNA的實驗組有很強的熒光信號與只轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1的信號強度相似,另外 GCRV感染的CIK細胞共轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1和EGFP-siRNA的實驗組 egfp mRNA的表達量也與感染細胞只轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1的對照組相似,它們都高于未感染細胞共轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1和EGFP-siRNA的對照組。說明感染 GCRV的CIK細胞中 siRNA介導(dǎo)的基因沉默受到了抑制;
　?、垩芯苛?/p>

8、 GCRV的復(fù)制與 Dicer轉(zhuǎn)錄水平的相互關(guān)系。提取 GCRV感染后0h,4h,8h,12h,16h,20h,24h以及28h的CIK細胞總 RNA,利用qRT-PCR測定每個時間點 Dicer的表達量以及用TCID50測定各時間點的病毒滴度。結(jié)果顯示,從第20h開始 Dicer mRNA大量表達(P﹤0.05),TCID50結(jié)果表明從第20h病毒復(fù)制量達到一個很高的水平,對二者進行相關(guān)性分析,相關(guān)系數(shù) R2為0.9572,說明 Di