草魚(yú)呼腸孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表達(dá)及VP5、VP7蛋白亞細(xì)胞定位研究.pdf

1、草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)為雙鏈分段RNA病毒,隸屬于呼腸孤病毒科水生呼腸孤病毒屬,是引起草魚(yú)出血病的主要病原,主要危害草魚(yú)魚(yú)種并引起草魚(yú)出血病,嚴(yán)重影響我國(guó)淡水漁業(yè)的發(fā)展。本研究從患出血病的草魚(yú)中分離草魚(yú)呼腸孤病毒將其命名為GCRV096。提取病毒基因組RNA,運(yùn)用同源序列擴(kuò)增法獲得vp5與vp7基因cDNA全長(zhǎng),并對(duì)其進(jìn)行表達(dá),而且研究了VP5、VP7蛋白的亞細(xì)胞定位。
　　 vp5基

2、因cDNA全長(zhǎng)為1981bp,ORF為1947bp,編碼648個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為68.65 kDa,理論等電點(diǎn)為6.13。GCRV096VP5氨基酸序列與金體美洲鳊魚(yú)呼腸孤病毒(GSRV)VP4氨基酸序列、草魚(yú)出血病病毒(GCHV)VP5氨基酸序列同源性較高,達(dá)90％以上。構(gòu)建了vp5原核表達(dá)載體pET-VP5,在大腸桿菌BL21中成功誘導(dǎo)表達(dá)；重組蛋白主要以包涵體形式存在,通過(guò)His TrapTM HP柱子純化重組蛋白;Weste

3、rnblot分析結(jié)果表明所表達(dá)的蛋白為目的蛋白。構(gòu)建了vp5基因的真核表達(dá)載體pEGFP-VP5,采用脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后在熒光顯微鏡中觀察到VP5重組蛋白能在CIK細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá),VP5重組蛋白在整個(gè)CIK細(xì)胞中都有分布,但主要分布在細(xì)胞核中。
　　 vp7基因cDNA全長(zhǎng)為852bp,ORF為831bp,編碼276個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量約為29.85kDa理論等電點(diǎn)為6.31。GCRV096VP7氨

4、基酸序列與溝鯰魚(yú)呼腸孤病毒(CCRV)VP7氨基酸序列同源性最高,達(dá)100％。構(gòu)建了vp7原核表達(dá)載體pET-VP7,在大腸桿菌BL21中成功誘導(dǎo)表達(dá)；重組蛋白主要以包涵體形式存在,通過(guò)His TrapTM HP柱子純化重組蛋白；Westernblot分析結(jié)果表明所表達(dá)的蛋白為目的蛋白。構(gòu)建了vp7基因的真核表達(dá)載體pEGFP-VP7采用脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后在熒光顯微鏡中觀察到VP7重組蛋白分布在整個(gè)CIK細(xì)