TaqMan實時定量PCR檢測輪狀病毒G4型VP7基因方法的建立.pdf

1、目的：建立基于TaqMan探針的實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測與定量輪狀病毒G4型VP7基因的方法。
　　 方法：輪狀病毒(Rotavirus，RV)是5歲以下兒童重癥腹瀉最主要的病原體，其感染引起的死亡占兒童死亡數(shù)的5％，其中90％發(fā)生在發(fā)展中國家。WHO推薦所有國家的免疫程序中應當包含輪狀病毒疫苗，以預防輪狀病毒感染。實時定量PCR(Polymerase chain reaction)可連續(xù)收集一只或多只PCR管中每個循環(huán)的熒光信

2、號，該信號與模板的拷貝數(shù)相關(guān)。一個完美的定量PCR其斜率為3.32，對應的擴增效率為100％，截距在33到37個循環(huán)之間且R2為1.00。本試驗目的是建立一種基于TaqMan(R)探針的快速、準確、特異的RV熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，用于RV G4型VP7基因的檢測及定量。使用RT-PCR(Reverse transcription PCR)以輪狀病毒G4型VP7基因為模板設計引物和探針，探針5'端距離上游引物3'端8bp，使用JOE標

3、記探針3'端報告基團，5'端標記Eclipe淬滅基團。從輪狀病毒G4型中擴增出VP7基因，將該基因構(gòu)建于質(zhì)粒并克隆培養(yǎng)。從質(zhì)粒中擴增并純化的VP7 DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄RNA。將該RNA純化并使用光度法定量，稀釋RNA至102-107拷貝/μl數(shù)量級作為RT-qPCR(Real time quantitative PCR)標準品，優(yōu)化PCR體系，通過絕對定量法測定樣品中G4型病毒RNA拷貝數(shù)。
　　 結(jié)果：所獲得的RNA標準品