牛輪狀病毒VP4基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、本研究以G6型牛輪狀病毒CHLY株的總RNA為模板，應(yīng)用RT—PCR技術(shù)擴(kuò)增牛輪狀病毒VP4基因，通過T—A克隆技術(shù)，將PCR產(chǎn)物克隆至pEASY—T3載體中，成功構(gòu)建出克隆質(zhì)粒pEASY—T3—VP4。經(jīng)雙酶切后再將該基因重組于原核表達(dá)載體pET32a（+）中，構(gòu)建出原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a—VP4。同時(shí)，以pET20b—LTB為模板PCR擴(kuò)增出LTB基因，以同樣的方法構(gòu)建出原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a—VP4—LTB。將pET32a—V

2、P4和pET32a—VP4—LTB分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS—PAGE分析，可見約108.4KD和115KD的融合蛋白帶，而未誘導(dǎo)的對(duì)照菌株沒有出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，即成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)VP4蛋白的基因工程菌株。對(duì)CHLY株VP4基因進(jìn)行了核酸序列測(cè)定和基因?qū)Ρ?，結(jié)果表明該病毒株的P血清型為P[1]型。 將純化的VP4融合蛋白和VP4—LTB融合蛋白作為抗原經(jīng)過肌肉注射免疫小鼠，并以純化的pET

3、32a的His—tag為對(duì)照，免疫7周后VP4融合蛋白和VP4—LTB兩個(gè)融合蛋白免疫組的血清牛輪狀病毒VP4 IgG抗體效價(jià)分別為8.1×103和16.3×103，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者沒有顯著差異（P>0.05），而與對(duì)照組具有顯著差異（P<0.05）。免疫母鼠所生小鼠在出生后4天，用107.2TCID50輪狀病毒CHLY株100μL進(jìn)行腹腔攻毒，攻毒后第3～7天對(duì)照組小鼠出現(xiàn)了典型的腹瀉癥狀，保護(hù)率為0，而經(jīng)過VP4蛋白免疫的母鼠所生