人類A組輪狀病毒Vp4的表達(dá)和抗原性研究.pdf

1、輪狀病毒(Rotavirus RV)是呼腸病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)，是引起人類、哺乳動(dòng)物類及鳥類病毒性胃腸炎的重要病原體。RV外面有三層衣殼蛋白，Vp4位于衣殼結(jié)構(gòu)的最外層，從RV表面形成刺突狀突起。Vp4具有血凝素作用，是病毒吸附進(jìn)入細(xì)胞的功能性蛋白和病毒主要的交叉中和抗原蛋白，在RV感染和復(fù)制過(guò)程中具有重要作用，也是研究和開發(fā)RV重組疫苗的重要靶蛋白。 本研究從臨床樣品中分離的A組人輪狀

2、病毒TB-Chen株的Vp4基因，用特殊設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以pET作為表達(dá)載體，將Vp4蛋白編碼基因序列插入到質(zhì)粒pET中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-Vp4，在大腸桿菌BL21(DE3)中(不用IPTG誘導(dǎo))高效表達(dá)了重組蛋白Vp4(recombinant Vp4，rVp4)。凝膠掃描分析結(jié)果顯示，rVp4占菌體總蛋白的17％。Western Blot結(jié)果顯示，表達(dá)的rVp4可被SA11和Wa的豚鼠免疫血清抗體特異性識(shí)別。表達(dá)的

3、rVp4經(jīng)純化和透析復(fù)性，成功得到部分二聚體。用表達(dá)的rVp4免疫豚鼠后所得的抗體做一抗，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG做二抗進(jìn)行的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，可檢測(cè)到在SA11和Wa株輪狀病毒感染不同階段的MA104細(xì)胞中表達(dá)的Vp4蛋白及其分布情況。研究結(jié)果說(shuō)明，抗rVp4的豚鼠血清抗體能交叉識(shí)別SA11和Wa株輪狀病毒的同源vp4蛋白。SA11和Wa感染MA104細(xì)胞后，Vp4的表達(dá)量在感染12小時(shí)左右達(dá)到最高，病毒的Vp4位于細(xì)胞核周圍或

4、沿細(xì)胞膜分布：用抗rVp4的豚鼠血清所做的中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗此rVp4的抗體能阻斷Wa和SA11對(duì)MA104細(xì)胞的感染。這些結(jié)果說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-Vp4；所用的大腸桿菌BL21(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)是重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-Vp4的良好表達(dá)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中不必用IPTG誘導(dǎo)：Western Blot結(jié)果說(shuō)明，表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性，能被SA11和Wa的豚鼠抗血清特異識(shí)別；同源對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)TB-Chen株

5、的Vp4基因和氨基酸序列與Wa和SA11的Vp4基因和氨基酸序列同源性并不是很高，但重組表達(dá)的rVp4的豚鼠血清抗體所做的免疫熒光實(shí)驗(yàn)提示，TB-Chen株的Vp4基因和Wa和SA11株RV的Vp4基因具有高度同源的抗原表位和中和抗原表位；對(duì)rVp4進(jìn)行的復(fù)性試驗(yàn)表明目前所用的復(fù)性條件并不是最理想的，并且復(fù)性后所得的二聚體是不是與TB-Chen株天然狀況下二聚體Vp4相同，有待進(jìn)一步證明?？傊?，本研究為A組輪狀病毒外殼蛋白Vp4的生物學(xué)