人類輪狀病毒VP8-蛋白與組織血型抗原相關(guān)性分析.pdf

1、目的：本研究擬通過基因工程技術(shù)表達五株我國輪狀病毒（Rotavirus，RV）流行株P(guān)[4]、P[6]和P[8]型RV的VP8*蛋白，并制備其多克隆抗體，通過酶免疫分析試驗（Enzyme immune assays，EIA）為基礎(chǔ)的唾液結(jié)合實驗和寡糖結(jié)合實驗分析我國主要基因型P[4]、P[6]和P[8]型毒株與組織血型抗原（Histo-blood group antigens，HBGAs）的相關(guān)性，以獲得我國RV流行株與HBGAs的結(jié)合

2、模式，從而確定輪狀病毒流行株感染的宿主范圍，為進一步研究RV與宿主受體之間的關(guān)系及RV疫苗和防治藥物的研發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：選擇P[4]型RV代表株11151099和11151328、P[6]型代表株5311142及P[8]型代表株11221075和11221345，根據(jù)已有引物對RV的VP8*區(qū)進行擴增，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-VP8*和表達質(zhì)粒pGEX-4T1-VP8*，利用GST

3、原核表達系統(tǒng)經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)、超聲破碎細胞及SDS-PAGE鑒定后證實在上清中獲得GST-VP8*融合蛋白，利用瓊脂糖-4B柱對融合蛋白進行純化并通過凝血酶去除GST標(biāo)簽以獲得VP8*蛋白。將純化的11151099、5311142和11221075的VP8*蛋白分別免疫2只20周齡的雌性SPF級新西蘭白兔，每只兔子免疫蛋白量約為100μg，首次加弗氏完全佐劑乳化，第二次開始采用弗氏不完全佐劑，注射體積為400μL，背部皮內(nèi)多點注射，共免

4、疫6次，ELISA檢測抗體效價。效價合格后進行全采血從耳部及心臟采取120-160mL血液，4℃過液離心獲得血清，4℃保存?zhèn)溆?。通過EIA唾液結(jié)合實驗分析3個型別的輪狀病毒流行株與唾液中的HBGAs受體的結(jié)合情況。利用HBGAs表型已明確的159份唾液樣本包被96孔酶標(biāo)板，封閉后加入已制備成功的P[4]、P[6]和P[8]型VP8*蛋白，以兔抗RV VP8*蛋白為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，TMB顯色，用酶標(biāo)儀在450nm波長

5、處測定OD值。通過5個毒株的VP8*蛋白對lea、leb、lex、ley、A、B、H1和H2型寡糖進行EIA為基礎(chǔ)的寡糖結(jié)合實驗。綜合唾液結(jié)合實驗和寡糖結(jié)合實驗分析五個輪狀病毒流行株與HBGAs受體的結(jié)合模式。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了我國五株RV流行株的pGEX-4T1-VP8*表達質(zhì)粒；制備了五株P(guān)[4]、P[6]和P[8]型RV VP8*蛋白，大小約為27kDa；成功獲得了兔抗P[4]、P[6]和P[8]型RV VP8*血清，E

6、IA檢測獲得的三個多克隆抗體的抗血清效價均達到1：62500，可以滿足實驗要求；首次通過游離VP8*蛋白的唾液結(jié)合實驗分析得到P[4]、P[6]和P[8]型RV與唾液HBGAs的結(jié)合模式，P[4]和P[8]型RV與A型、B型、AB型、O型分泌型（O+）中的leb抗原陽性的唾液結(jié)合，與O型非分泌型（O-）唾液不結(jié)合；而P[6]型RV5311142與A型、B型、AB型、O+型、O-型唾液均不結(jié)合；通過寡糖結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)P[4]和P[8]型RV

7、可以與leb和H1型抗原結(jié)合，而P[6]型RV5311142與各型寡糖均不結(jié)合。
　　結(jié)論：HBGAs與P[4]、P[6]和P[8]型RV的結(jié)合呈現(xiàn)毒株特異性。由唾液及寡糖結(jié)合實驗綜合分析發(fā)現(xiàn)P[4]和P[8]型RV可以與leb和H1型抗原結(jié)合，與O-型抗原不結(jié)合；P[6]型RV5311142與ABO、Lewis和分泌型抗原均無顯著結(jié)合。本研究通過五株P(guān)[4]、P[6]和P[8]型RV VP8*蛋白的成功表達及唾液、寡糖結(jié)合實驗的