傳染性法氏囊病病毒VP4和VP5蛋白基因真核表達載體的構(gòu)建、表達及對Ⅰ型干擾素信號通路的影響.pdf

1、雞傳染性法氏囊病是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infections bursal disease virus，IBDV)引起的一種急性、高度接觸性和免疫抑制性的傳染病。IBDV屬于雙RNA病毒科雙RNA病毒屬，IBDV基因組有兩個雙股的RNA片段，分別為A片段和B片段。A片段長約3.2 kb，包括兩個部分重合的開放閱讀框（open reading frame，ORF），第一個ORF編碼VP5，第二個ORF編碼VP2-VP4-VP3。VP4是

2、病毒的蛋白酶，具有絲氨酸(Ser)蛋白酶的活性，因此，VP4的主要作用是對多聚前體蛋白VP2-VP4-VP3進行加工，放出VP2和VP3兩個主要的結(jié)構(gòu)蛋白。VP5蛋白是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，在IBDV感染的過程中能夠引起細胞凋亡。
　?、裥透蓴_素（Interferon，IFN）是機體細胞抵抗病毒感染的第一道防線。Ⅰ型IFN的產(chǎn)生乖發(fā)揮效應(yīng)是通過IFN產(chǎn)生的信號通路（IFN Production Pathway）和IFN發(fā)揮效應(yīng)的信號通路

3、（IFN Working Signal Pathway）來實現(xiàn)的。具體而言，病毒感染機體后，細胞能夠產(chǎn)生Ⅰ型IFN并且很快釋放到細胞外，從而使細胞建立抗病毒狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，IBDV能夠通過抑制IFN基因的轉(zhuǎn)錄來抑制機體的先天性免疫應(yīng)答，但究竟是IBDV的哪個蛋白參與引起機體Ⅰ型IFN的下調(diào)，并未做深入研究。
　　本研究將構(gòu)建IBDV各病毒蛋白基因的真核表達載體，與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細胞，運用研究Ⅰ型IFN信號通路的經(jīng)典方法熒光

4、素酶試驗，研究IBDV的VP4和VP5蛋白對RIG-Ⅰ(Retinoic acid-inducible geneⅠ)介導的信號通路、IRF3(Interferon regulatoryfactor3，IRF3)、NF-κB(Nuclear factor kappa B)等IFN產(chǎn)生或者發(fā)揮效應(yīng)的信號通路，尤其是JAK-STA信號通路的影響。為研究IBDV的感染和發(fā)病機制提供重要的理論參考，并為預(yù)防和控制IBDV感染提供新的靶向分子。主要

5、研究內(nèi)容如下:
　　試驗Ⅰ.IBDV病毒蛋白基因真核表達載體的構(gòu)建與表達
　　為了構(gòu)建病毒蛋白基因的真核表達載體，根據(jù)IBDV CV03株各基因片段測序的基因序列和GenBank發(fā)表的B87株的基因序列，設(shè)計一系列N端帶Flag標簽的引物，分別用于擴增CV03株VP1、VP2、VP3、VP4和VP5以及B87株VP4和VP5蛋白的基因，連接pMD19-T載體進行序列分析，將正確的序列連接真核表達載體pCI-neo，構(gòu)建各基因

6、的真核表達載體pCI-CV03VP1、pCI-CV03VP2、pCI-CV03VP3、pCI-CV03VP4、pCI-CV03VP5及pCI-B87VP4和pCI-B87VP5并進行雙酶切鑒定，結(jié)果符合目的基因條帶大小。用Western-blotting檢測真核表達載體在Vero細胞中的表達情況，結(jié)果顯示有符合目的蛋白大小的特異性條帶存在，IFA檢測進一步證明了所構(gòu)建的真核表達載體具有較好表達能力。
　　試驗Ⅱ.VP4和VP5蛋白

7、對Ⅰ型IFN產(chǎn)生和發(fā)揮作用信號通路的影響
　　為了研究IBDV VP4和VP5蛋白對Ⅰ型IFN產(chǎn)生和發(fā)揮作用的信號通路Jak-stat信號通路轉(zhuǎn)導的影響，構(gòu)建了IBDV CV03株所有的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因的真核表達載體，與pIFN-β-Luc報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細胞，轉(zhuǎn)染poly(I∶C)進行刺激，發(fā)現(xiàn)IBDV的VP4蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白VP5能夠明顯降低IFN-β啟動子的活性，從而明顯降低IFN的產(chǎn)生，而VP1、VP2和VP

8、3的作用相對較弱。同時用弱毒株B87的VP4和VP5蛋白基因的真核表達載體，與CV03的VP4和VP5作對照，與pIFN-β-Luc報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3-RIG-Ⅰ刺激細胞，發(fā)現(xiàn)兩株病毒的VP4和VP5蛋白能夠明顯抑制RIG-Ⅰ介導IFN信號通路的活性。分別將報告質(zhì)粒p4xIRF3-Luc和pNF-κB-Luc與兩株病毒的VP4和VP5蛋白基因的真核表達載體共轉(zhuǎn)染Vero細胞，研究發(fā)現(xiàn)，VP4和VP5蛋白能夠明顯