草魚Ajuba蛋白在草魚呼腸孤病毒感染CIK細(xì)胞過程中的表達(dá)及功能探討.pdf

1、Ajuba屬于LIM蛋白第三類中的Zyxin蛋白家族，含有雙鋅指結(jié)構(gòu)的LIM結(jié)構(gòu)域，其主要作用是參與蛋白質(zhì)之間的相互作用。Ajuba影響著生物體生長發(fā)育的基本過程——有絲分裂，調(diào)控細(xì)胞周期；是細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，參與細(xì)胞粘附及細(xì)胞間的信息交流；作為轉(zhuǎn)錄共抑制因子，參與調(diào)解不同的生理過程，甚至與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。而且，Ajuba參與核轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族NF-κB的激活反應(yīng)，NF-κB能夠調(diào)控很多與早期免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)相關(guān)的分子。草魚呼腸孤病毒

2、引發(fā)的草魚出血病，危及中國淡水養(yǎng)殖業(yè)，給漁民造成極大的損失。針對草魚呼腸孤病毒分子結(jié)構(gòu)及基因功能的研究是明確病毒侵染宿主機(jī)制的基礎(chǔ)，而對草魚呼腸孤病毒蛋白與宿主蛋白的相互作用研究則是攻克草魚出血病的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　基于此，本課題主要從以下幾個方面進(jìn)行研究：
　　1.草魚Ajuba基因的克隆與表達(dá)
　　根據(jù)酵母雙雜交技術(shù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)特異性引物，結(jié)合RACE技術(shù)，擴(kuò)增得到草魚Ajuba基因（gcAjuba）cDNA

3、全長3980bp，GenBank登錄號為KC551289.1。其中，5’非編碼區(qū)1215bp，3’非編碼區(qū)644bp，開放閱讀框（ORF）2121bp，編碼706個氨基酸，分子量約為75.966kDa。等電點(diǎn)（pI）為7.87，不穩(wěn)定系數(shù)為64.48。生物學(xué)分析，蛋白gcAjuba含有3個碳末端保守LIM結(jié)構(gòu)域。氨基酸比對發(fā)現(xiàn)，gcAjuba與斑馬魚Ajuba氨基酸序列同源性最高，與哺乳動物Ajuba也具有較高的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示

4、，gcAjuba與魚類親緣關(guān)系最近，與哺乳動物親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。
　　2.GCRV-JX01感染下gcAjuba基因的表達(dá)研究
　　為明確草魚呼腸孤病毒感染條件下gcAjuba的表達(dá)模式，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)檢測gcAjuba在GCRV-JX01感染后0h、4h、8h、12h、24h五個時間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況，使用相對定量的方法，以草魚EF1a為內(nèi)參基因，檢測gcAjuba基因在不同時間的表達(dá)水平差異。結(jié)果顯示，gcAjuba在GCRV-J

5、X01病毒毒株感染刺激后4h達(dá)到最高表達(dá)量，且明顯上調(diào)。說明gcAjuba基因是一個病毒可誘導(dǎo)基因，參與草魚呼腸孤病毒侵染宿主途徑。
　　3.草魚Ajuba與GCRV NS26相互作用的初步探究
　　成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-gcAjuba和pcDNA3.1-NS26，共轉(zhuǎn)入草魚CIK細(xì)胞。亞細(xì)胞定位顯示，草魚蛋白gcAjuba和病毒蛋白NS26均分布于細(xì)胞質(zhì)中，但兩者表達(dá)位置并沒有完全重疊。應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)，證明融合蛋

6、白GFP-gcAjuba和His-NS26之間沒有直接相互作用。
　　本研究成功克隆草魚Ajuba基因，首次獲得草魚Ajuba cDNA序列全長，并對其蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)與生物學(xué)分析，為進(jìn)一步探究草魚Ajuba的生物學(xué)功能做好鋪墊。而且證明gcAjuba是草魚呼腸孤病毒感染細(xì)胞下的可誘導(dǎo)蛋白，結(jié)合Ajuba參與免疫系統(tǒng)這一論斷，為草魚呼腸孤病毒的防控機(jī)制提供新的思路。然而，由酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)得出的gcAjuba與NS26的相互作用在體