草魚呼腸孤病毒混合感染及其致細(xì)胞病變效應(yīng)的蛋白組學(xué)分析.pdf

1、草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)引發(fā)草魚病毒性出血病,是危害性極大的草魚病原體。該病毒基因組由11條雙鏈RNA組成,共編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。GCRV的感染使宿主細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞融合、凋亡、應(yīng)急顆粒產(chǎn)生等病理變化。
　　全長(zhǎng)cDNA測(cè)序技術(shù)(Full-length amplification of cDNA, FLAC)是dsRNA病毒準(zhǔn)確、高效的基因組測(cè)序方法,廣泛應(yīng)用于水生呼腸孤病毒基

2、因組研究。雙向電泳和質(zhì)譜鑒定相結(jié)合的蛋白組學(xué)方法是研究病毒與宿主細(xì)胞相互作用機(jī)理有效的手段。
　　本文利用FLAC技術(shù)、real-time RT-PCR、蛋白組學(xué)方法等對(duì)以下四個(gè)方面進(jìn)行研究:
　　1.從江西采集的患病草魚中分離GCRV病毒,利用FLAC技術(shù)擴(kuò)增得到其部分基因的全長(zhǎng)cDNA序列,Blast比對(duì)顯示其分別與GCRV-873和GCRV-GD108同源性為99％,揭示了我國(guó)草魚主要養(yǎng)殖區(qū)存在兩株同源性較低的GCRV

3、毒株,分別命名為GCRV-JX01和GCRV-JX02;混合感染所占疫情的比例為55%,高于單一毒株感染(30%)。
　　2.通過無限稀釋法和RT-PCR分離純化兩株病毒,利用real-time RT-PCR分別比較了兩株GCRV單獨(dú)感染和混合感染時(shí)在細(xì)胞和上清中的復(fù)制效率差異。結(jié)果顯示:在細(xì)胞中,混合感染時(shí)GCRV-JX02的復(fù)制效率高于單獨(dú)感染,GCRV-JX01較單獨(dú)感染時(shí)則降低,但兩株病毒均能正常復(fù)制擴(kuò)增;在上清中,兩株病

4、毒的復(fù)制效率較單獨(dú)感染時(shí)無顯著變化。鑒于兩株病毒進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),通過魚體注射滅活疫苗,運(yùn)用Dot-blot和熒光定量方法監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制水平,證明針對(duì)其中一株病毒產(chǎn)生的抗體不能識(shí)別另一株病毒,即兩株病毒無免疫交叉保護(hù)。
　　3.通過雙向電泳技術(shù)鑒別宿主細(xì)胞(CIK)在GCRV-JX01感染6 h、12 h和24 h后與未感染組的蛋白表達(dá)差異點(diǎn),其中選取23個(gè)表達(dá)量上調(diào)大于3倍的差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,并歸納了這些蛋白質(zhì)發(fā)揮的生物學(xué)功能:細(xì)胞

5、骨架(31%)、細(xì)胞應(yīng)激顆粒產(chǎn)生(9%)、信號(hào)傳導(dǎo)(13%)、能量代謝相關(guān)(13%)、泛素化信號(hào)通路(17%)和其它未知功能蛋白(17%)。
　　4.克隆GCRV-JX01的NS16、NS31、NS38、VP6和VP7基因,并用Western-blot技術(shù)驗(yàn)證其在CIK細(xì)胞中的表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示:NS31分布于整個(gè)細(xì)胞,在特定部位高表達(dá);NS16分布于細(xì)胞質(zhì)中,在特定部位高表達(dá);NS38、VP7和VP6均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中;單