豬鏈球菌2型免疫蛋白組學(xué)和比較蛋白組學(xué)研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌,有35個(gè)血清型,其中SS2致病力最強(qiáng),可引致豬的急性敗血癥及相關(guān)人員感染而死亡,造成較大的經(jīng)濟(jì)損失,產(chǎn)生重大的社會(huì)影響,成為公共衛(wèi)生突發(fā)事件,倍受世人關(guān)注。 為了進(jìn)一步了解SS2免疫及致病機(jī)制,本文使用蛋白組學(xué)的方法對(duì)其進(jìn)行研究,以期發(fā)現(xiàn)新的免疫原性蛋白及尋找新毒力標(biāo)志物。 為了高通量地篩選亞單位疫苗的候選物,本試驗(yàn)采用了免疫蛋白組學(xué)的方法,對(duì)SS2的可

2、刺激宿主產(chǎn)生抗體的分泌蛋白(extracellular proteins)、膜相關(guān)蛋白(membrane-associated proteins,MAP)和細(xì)胞壁蛋白(cell-wall proteins,CWP)分別進(jìn)行了篩選。 應(yīng)用免疫蛋白組學(xué)方法,分析SS2的分泌蛋白,以SPF微型豬SS2康復(fù)血清為一抗,HRP-SPA為二抗,對(duì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜的中國(guó)分離株ZY05719及HA9801的上清蛋白,檢測(cè)具有免疫原性的蛋白。將重

3、復(fù)膠上與之對(duì)應(yīng)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。共鑒定出7個(gè)免疫原性蛋白,其中包括溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein,MRP)、胞外因子(extracellurlar factors,EF)和溶血素(suilysin,SLY),同時(shí)還發(fā)現(xiàn)4個(gè)以前未被報(bào)道的免疫原性蛋白。 用Triton X-114法富集SS2 HA9801的膜相關(guān)蛋白。作免疫蛋白組學(xué)分析,以SPF微型豬SS2免疫血清為

4、一抗,HRP標(biāo)記的羊抗豬為為二抗,對(duì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的HA9801膜相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)?？偣舶l(fā)現(xiàn)13個(gè)免疫原性的蛋白,將重復(fù)膠上相應(yīng)的點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè),全部成功地被鑒定出來(lái),其中7個(gè)為首次報(bào)道。 用變?nèi)芫胤ㄌ崛S2 HA9801的細(xì)胞壁蛋白.應(yīng)用免疫蛋白組法,以SPF微型豬的免疫血清為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗豬為二抗,對(duì)轉(zhuǎn)印到PDVF膜上的CWP蛋白進(jìn)行檢測(cè),并將重復(fù)膠上相應(yīng)的點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOP-MS檢

5、測(cè)。共有有11蛋白點(diǎn)個(gè)被檢出有免疫原性,用質(zhì)譜鑒定屬于7種蛋白,其中4種為首次報(bào)道。自然界中存在的SS2包括有強(qiáng)毒株和無(wú)毒株。本試驗(yàn)采用比較蛋白組學(xué)的方法,比較了SS2兩株強(qiáng)毒株(HA9801和ZY05719)與無(wú)毒株T15蛋白二維表達(dá)圖譜,以期確認(rèn)和發(fā)現(xiàn)SS2毒力標(biāo)志物。 在對(duì)強(qiáng)毒株(HA9801和ZY05719)與弱毒株(T15)之間的分泌蛋白的二維電泳圖譜比較中,一共發(fā)現(xiàn)了九個(gè)差異點(diǎn),其中的八個(gè)被生物質(zhì)譜成功鑒定,其中包括

6、包括MRP、EF、SLY。根據(jù)差異蛋白的基因合成引物,以三株SS2菌株DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,其中有5對(duì)引物在三株細(xì)菌中均擴(kuò)增出相應(yīng)基因,一對(duì)引物均未擴(kuò)出,二對(duì)僅在強(qiáng)毒株中擴(kuò)增出。 同樣采用比較蛋白組學(xué)的方法,比較HA9801和ZY05719與T15菌體蛋白的二維表達(dá)圖譜。在強(qiáng)毒株與弱毒株之間,一共鑒定出3個(gè)差異點(diǎn)。根據(jù)差異蛋白的基因合成引物,以三株SS2菌株DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,PCR結(jié)果表明,此三種蛋白的基因僅在強(qiáng)毒株中分布。